单克隆抗体中分析表征检测方案

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应用笔记 一TSKgel色谱柱 采用 TSKgel"FcR-IIIA-NPR色谱柱分离单抗及 Top-down 质谱的分析表征 简介 单克隆抗体(mAb)是目前市场上最大的糖蛋白治疗药物，而且糖基化是引起 mAb 异质性的主要原因。我们已经知道， mAb 的 IgG-Fc 片段的N-糖基化会影响药物治疗作用机制(MOA)，因此监测聚糖的关键质量属性 (CQA)是研发生物药物时的重要步骤。同时，糖基化也是影响药物溶解度、动力学、稳定性、功效和免疫原性的关键因素。因此，需使用一系列不同色谱模式的高效液相色谱法来分析完整蛋白和消化后蛋白片段的糖基化情况。 TSKgel FcR-IIIA-NPR 色谱柱是一款主要用于分析 IgG 糖型的亲和色谱柱。将重组 FcR-IIIA 蛋白键合到无孔的亲水性聚甲基丙烯酸树脂的填料上作为固定相。这种保留机制是基于FcR 配基与单克隆抗体保守区域内连接在 ASN 氨基酸上的糖基间的相互作用。糖蛋白的最终洗脱曲线反映了 ADCC 的活性，其与N-糖链的构成是相关联的。 本研究的目的是表明，使用质谱法表征 TSKgel FcR-IIIA-NPR色谱柱上分离出来的典型 IgGi洗脱组分，并且验证某些聚糖结构(特别是末端半乳糖的存在)会使单克隆抗体具有更高活性这一观察结果。 HPLC 分析条件 TSKgel FcR-IIIA-NPR 分离 色谱柱： TSKgel FcR-IIIA-NPR， 5 um， 4.6 mm ID × 7.5 cm仪器： Agilent 1200 流动相： A： 50 mmol/L 柠檬酸钠， pH 6.5B： 50 mmol/L 柠檬酸钠， pH 4.5梯度： 0 min：0% B， 20 min：100% B， 30 min， 100% B流速： 0.85 mL/min检测： UV @ 280 nm， 25 Hz温度： 15℃进样量： 5 uL 样品： NIST mAb 片段；流动相A中 5 mg/mL Top-down MS 表征 色谱柱： TSKgel Protein C4-300， 3 um， 2.0 mm ID×15 cm仪器： Shimadzu NexeraXR流动相： A： 0.1%甲酸水溶液B：0.1%甲酸乙腈溶液梯度： 0 min：10% B. 40 min：95% B. 50 min：95% B流速： 0.2mL/min检测： Sciex X500B Q-TOF， ESI 正极， m/z 900-4000温度： 50℃进样量： 5pL样品： NIST mAb 片段； LC/MS水溶液中 100 ug/mL MS 条件： Source gasl 50 psi Spray voltage 5000eV Source gas2 50 psi Declustering potential 250eV Curtain gas 50 psi DP spread 0eV CAD gas 7 psi Collision energy 10 eV Source temp 400°C CE spread 0 eV Accumulation time 1 sec Bins to sum 80 结果和讨论 图1 显示了 NIST mAb 在TSKgel FcR-IIIA-NPR 色谱柱上的分离结果。IgGi 分子基于糖链组成而分离获得的这一典型洗脱曲线与抗体 ADCC 活性是一致的。这就提供了一种快速正交的色谱法，可用来测定抗体活性和比较抗体异质性。 收集三个最大的洗脱组分并进行离线质谱分析。峰馏分通过连续25 ug 上样合并、浓缩、缓冲液置换为 LC/MS 级水。 图1.TSKgel FcR-IIIA-NPR 上 NIST mAb 的洗脱曲线放大图。方框标出的峰表示收集到的组分。 组分1 图2和3是收集到的峰组分与 NIST mAb 标品的对比分析图。可以观察到，每个峰都包含由独有糖链组成的完整单抗，且固定相的选择性是基于聚糖链末端半乳糖的单位数量。已有研究表明，含有更多 G1-和 G2-糖的抗体具有较高的 ADCC 活性。图2和3中的实验结果与该研究结论相一致。尽管由于初始分离的部分峰重叠而导致 MS 谱中不同半乳糖含量的组分峰的重叠，但半乳糖与抗体活性之间的关系之总趋势得到证实。 图2. TIC， NIST mAb 对照样品的提取光谱和重建光谱。该样品的糖型与文献中该分子的表征结果一致。 光谱出自103118003.wiff2(样品1) -NIST mAB0.1 ug/uL 水溶液， +TOF MS (900-4000) 从28.807到30.364 min 重建，输入光谱同位素分辨率：2500 148039.8 1000 片段1 4 1900 800 700 6 3000 9 148685.9 148773.8 2000 12 148844.3 1000 148281.5 148998.5 41 nw146600 146800 147000 147200 147400 147600 147800 148000 148200 148400 148600 148800 149000 149200 149400 Da质量 Peak Mass Glycoform Peak Mass Glycoform 1 147620 G0F/G0F (-2GIcNAc) 7 148292 G0F/G1F (Adduct) 2 147756 G0F/G0F (-GIcNAc) 8 148362 G1F/G1F 3 147966 G0F/G1F (-GIcNAc) 9 148455 G1F/G1F(Adduct) 4 148038 G0F/GOF 10 148524 G1F/G2F (+Hex) 5 148129 GOF/G0F (Adduct) 11 148684 G2F/G2F (+Hex) 6 148200 G0F/G1F 12 148843 G2F/G2F TSKgel 和 Tosoh Bioscience 是 Tosoh Corporation 的注册商标。 Nexera 是 Shimadzu Corporation 的注册商标。 结论 我们使用 TSKgel FcR-IIA-NPR色谱柱对 IgGi进行了分离，并通过高分辨率质谱法对分离出来的峰进行表征。实验结果表明，固定相的分离选择性是基于 Fc-聚糖与 Fc受体间的相互作用(即ADCC活性)。每个峰的糖型构成符合公开文献报道，即末端半乳糖含量与抗体活性高相关这一观察结果。 本应用显示了该分析方法和表征数据的有效性，证明了TSKgel FcR-IIIA-NPR色谱技术用于快速正交分析评估 mAbADCC 活性的可行性。可用于早期细胞系开发、生物反应器建模以及治疗性抗体药物产品批次间的比较等。 单克隆抗体是目前市场上最大的糖蛋白治疗药物，而且糖基化是引起mAb异质性的主要原因。我们已经知道，mAb的IgG-Fc片段的N-糖基化会影响药物治疗作用机制（MOA），因此监测聚糖的关键质量属性（CQA）是研发生物药物时的重要步骤。同时，糖基化也是影响药物溶解度、动力学、稳定性、功效和免疫原性的关键因素。因此，需使用一系列不同色谱模式的高效液相色谱法来分析完整蛋白和消化后蛋白片段的糖基化情况。TSKgel FcR-IIIA-NPR 色谱柱是一款主要用于分析IgG糖型的亲和色谱柱。将重组FcR-IIIA蛋白键合到无孔的亲水性聚甲基丙烯酸树脂的填料上作为固定相。这种保留机制是基于FcR配基与单克隆抗体保守区域内连接在ASN氨基酸上的糖基间的相互作用。糖蛋白的最终洗脱曲线反映了ADCC的活性，其与N-糖链的构成是相关联的。本资料中的研究目的是表明，使用质谱法表征TSKgel FcR-IIIANPR色谱柱上分离出来的典型IgG1 洗脱组分，并且验证某些聚糖结构（特别是末端半乳糖的存在）会使单克隆抗体具有更高活性这一观察结果。