巴氏杀菌乳中乳铁蛋白检测方案

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巴氏杀菌乳中乳铁蛋白的提取与检测一食品中乳铁蛋白的测定(2021征求意见稿) 背景 乳铁蛋白作为一种具备抗病毒、抑制游离基形成、调节人体铁质转移、促进细胞生长并提高免疫力等重要作用的功能性蛋白，目前已广泛添加在乳制品中以期发挥其功能。此前对于乳铁蛋白含量的检测尚未形成统一的方法，《食品安全国家标准食品中乳铁蛋白的测定(2021征求意见稿)》的出台，加速了乳铁蛋白检测向标准化方向发展的进程，本文完全按照此标准的操作流程，使用纳谱分析研发的 SelectCoreHeparin 肝素亲和柱进行了柱容量验证及加标回收率测定，使用 ChromCore 300A C4-T 色谱柱进行色谱分析，结果均符合国标要求，为乳制品中牛乳铁蛋白的检测提供了全套的整体解决方案。 适用范围 本方法适用于巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料、乳基婴幼儿配方食品中牛乳铁蛋白含量的测定。 实验步骤 1、试剂的准备 磷酸盐缓冲液I：称取7.10g磷酸氢二钠， 58.40g氯化钠，加适量水溶解，用磷酸调 pH至8.0±0.2，加水稀释至1000 mL. 磷酸盐缓冲液II：称取28.40g磷酸氢二钠，加800mL水溶解，用磷酸调节 pH至7.5±0.2，加水稀释至1000mL。 三氟乙酸溶液(0.1%)：吸取1mL三氟乙酸，加水稀释至1000 mL， 过0.45 um 滤膜。 2、样品的制备 2.1液态试样(巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料) 称取5g(精确至0.01g)试样于烧杯中，加入适量磷酸盐缓冲液II混匀，分次将样品转移至25 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液I定容至刻度，充分混匀后转入离心管，在4℃下以10000 r/min 转速离心12-15 min，取上清液于另一50 mL 离心管中，4℃下以10000 r/min 转速离心12-15 min， 取样液待净化。 2.2固态试样(乳基婴幼儿配方食品) 称取5g(精确至0.01g)试样于烧杯中，加入温热(温度不超过50℃)的磷酸盐缓冲液II，搅拌使样品溶解，分次将样品转移至 50 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液II定容至刻度后，充分混匀后转入离心管，在4℃下以10000 r/min 转速离心12-15 min， 取上清液于另一50 mL 离心管中，4℃下以10000 r/min 转速离心12-15min， 取样液待净化。 3、固相萃取方法 活化： SelectCore Heparin 肝素亲和柱1mL， 加入 5.0 mL 磷酸盐缓冲液II活化； 上样：准确移取步骤2中制备好的样液 10.0 mL，控制流速在1 mL/min-3 mL/min， 弃去流出液； 淋洗：使用10.0mL磷酸盐缓冲液II淋洗，弃去全部流出液； 洗脱：：用5.0mL磷酸盐缓冲液I洗脱，收集全部洗脱液，用磷酸盐缓冲液I定容至 5.0 mL， 过 0.22 um 滤膜，供上机检测分析用。 4、柱容量验证 在 20.0 mL 磷酸盐缓冲液Ⅱ中添加2 mg 牛乳铁蛋白标准储备溶液，充分混匀，分别取同一批次3根肝素亲和柱，每根柱的上样量为20.0mL，经上样，淋洗，洗脱，磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至5.00 mL，用高效液相色谱仪测牛乳铁蛋白的含量。 结果判定：牛乳铁蛋白回收率≥80%，为可使用的商品。 5、液相色谱仪器条件 Column： ChromCore 300A C4-T， 5 um Dimension： 4.6×250 mm Mobile Phase： A)三氟乙酸溶液(0.1%) B)乙腈 Gradient： t(min) A B85 1520 15 8522 85 1525 85 15 Flow rate：1.0 mL/min Temperature： 30°C Injection： 50 pL Detection：UV 280 nm 实验谱图 巴氏杀菌乳 牛乳铁蛋白标准品 Time [min] 图1牛乳铁蛋白标准品、巴氏杀菌乳、巴氏杀菌乳加标对比图 柱容量验证回收率 SelectCore Heparin 肝素亲和柱编号 牛乳铁蛋白回收率 1 93.26% 2 92.67% 3 92.85% 加标回收率 加标量 加标回收率 0.1g/kg 102.21% 实验结论 由色谱图结果可以看出 SelectCore Heparin 肝素亲和柱对于牛乳铁蛋白的专属性较高，即使巴氏杀菌乳这种成分比较复杂的样品，，目标物周围也无杂质干扰，搭配使用 ChromCore 300A C4-T色谱柱，可以做到准确积分、精确计算。 SelectCore Heparin 肝素亲和柱柱容量验证回收率均在90%以上，远大于标准中规定的80%，并且回收率稳定性良好， RSD 仅为0.3%，做此验证时，同时对比了其他厂家的肝素亲和柱柱容量验证结果，其中厂家M柱容量验证回收率仅有75%，不符合国标要求。 在使用 SelectCore Heparin 肝素亲和柱进行固相萃取操作时，也同样选择厂家M 肝素亲和柱进行了相同的实验操作，在上样这一步， 10 mL的上样液，由于纳谱分析采用单分散聚丙烯酸酯为基球， SelectCore Heparin肝素亲和柱只需5分钟即可全部过柱，并且滴速稳定，而厂家M 肝素亲和柱则需要10分钟以上才能完全过柱，滴速会随着上样液体积的增加而变慢。 加标回收率实验也同时对比了厂家M的结果， SelectCore Heparin 肝素亲和柱加标回收率为102.21%，符合检测要求，而厂家M加标回收率仅为87%。综合以上实验现象及结果，选择纳谱分析的 SelectCore Heparin肝素亲和柱，并搭配使用 ChromCore 300A C4-T色谱木，，可以高效、准确的进行牛乳铁蛋白含量的测定。 纳谱分析NanoChrom纳谱分析技术(苏州)有限公司Phone： E-mail： customerservice@nanochrom.com Web： www.nanochrom.com SelectCore Heparin肝素亲和柱编号牛乳铁蛋白回收率193.26%292.67%392.85%