食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠检测方案(液相色谱仪)

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【仪电分析】食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定-液相色谱法 苯甲酸、山梨酸和糖精钠是常用的食品添加剂，也是衡量食品卫生质量的重要指标。苯甲酸、山梨酸具有防腐保鲜的作用，糖精钠是合成甜味剂，甜度比蔗糖甜300-500倍。GB2760-2016《食品安全国家标准食品剂加剂使用标准》对这三者的添加范围和限量都有明确的规定，超范围或者超限量使用都是违法的。 GB5009.28-2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》对其检测方法做了规定，有高效液相色谱法和高效气相色谱法，其中高效液相色谱法为第一法仲裁法被广泛应用。 本方案参考 GB 5009.28-2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》中第一法：液相色谱法，该法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定。 -、方法原理 样品经水提取，高脂肪样品经正己烷脱脂、高蛋白样品经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，采用液相色谱分离、紫外检测器检测，外标法定量。 二、主要仪器及试剂 a. 高效液相色谱仪： LC220，配备紫外检测器； b.自动进样器： AS2000； c.色谱柱： C18柱，4.6mmx250mm， 粒径为5 um； d.分析天平； e.涡旋振荡器； f.离心机； g.超声波发生器； h.苯甲酸、山梨酸、糖精钠水溶液混合溶液： p=1000mg/L； i.氨水； j.亚铁氰化钾； k.乙酸锌； 1.无水乙醇； m.正己烷； n.甲醇：色谱纯； o.乙酸铵：色谱纯； p.甲酸：色谱纯。 三、实验方法 3.1参考色谱条件 色谱柱 C18(250mmx4.6mmx5um) 流速 1mL/min 波 长 230nm 柱温 28℃或室温 进样量 10uL 流动相 甲醇+乙酸铵溶液=5+95。 注：当存在干扰峰或需要辅助定性时， 可以采用加入甲酸的流动相来测定，如流动相：甲醇+甲酸-乙酸铵溶液=8+92。 3.2标准系列的制备 3.2.1苯甲酸、山梨酸和糖精钠(以糖精计)混合标准中间溶液(200mg/L))：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准储备溶液各 10.0mL 于 50mL容量瓶中，用水定容。于4℃贮存，保存期为3个月。 3.2.1苯甲酸、山梨酸和糖精钠(以糖精计)混合标准系列工作溶液：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸和糖精钠混合标准中间溶液0mL、0.05mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL和10.0mL，用水定容至10mL，配制成质量浓度分别为 0mg/L、1.00 mg/L、5.00 mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100mg/L和 200mg/L 的混合标准系列工作溶液。临用现配。 3.3样品制备 3.3.1样品准备 取多个预包装的饮料、液态奶等均匀样品直接混合；非均匀的液态、半固态样品用组织匀浆机匀浆；固体样品用研磨机充分粉碎并搅拌均匀；奶酪、黄油、巧克力等采用50℃~60℃ 加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。取其中的200g装入玻璃容器中，密封，液体试样于4℃保存，其他试样于-18℃保存。 3.3.2试样提取 a..一般性试样 准确角取约2g(精确到0.001 g) 试样于50 mL 具塞离心管中，加水约25mL， 涡旋混匀，于50℃水浴超声 20min，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液 2mL 和乙酸锌溶液2mL，混匀，于8000r/min 离心5min， 将水相转移至 50mL 容量瓶中，于残渣中加水20mL， 涡旋混匀后超声5min， 于 8000r/min 离心5 min ， 将水相转移到同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过 0.22 pm滤膜，待液相色谱测定。 注：碳酸饮料、果酒、果汁、蒸馏酒等测定时可以不加蛋白沉淀剂。 b.含胶基的果冻、糖果等试样 准确取约2g(精确到0.001g)试式于 50 mL 具塞离心管中，加水约25 mL，涡旋混匀，于70℃水浴加热溶解试样，于50℃水浴超声 20 min， 之后的操作同2.2.1。 c.油脂、巧克力、奶油、油炸食品等高油脂试样 准确确取约2g(精确到 0.001 g)试样于 50 mL 具塞离心管中，加正已烷 10 mL，于60℃水浴加热约5 min， 并不时轻摇以溶解脂肪，然后加氨水溶液(1+99)25 mL， 乙醇1mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声 20 min， 冷却至室温后，加亚铁氰化钾溶液2mL 和乙酸锌溶液2mL，混匀，，于8000 r/min 离心5 min，弃去有机相，水相转移至50mL容量瓶中，残渣同3.3.2(a)再提取一次后测定。 四、实验结果 4.1标准工作曲线 苯甲酸、山梨酸和糖精钠的标准工作曲线如图1-图3所示，其中苯甲酸线性回归方程为：y=27240.5x，相关系数r为0.9998。山梨酸线性回归方程为：y=53259.5x，相关系数r为0.9995。糖精钠线性回归方程为： y=17221x，相关系数r为0.9998。 响应值 图1苯甲酸标准工作曲线 响应值 图2山梨酸标准工作曲线 响应值 图3糖精钠标准工作曲线 4.2混合标准溶液图谱 浓度为 100mg/L 的混合标准溶液的色谱图如图4所示： 图4混合标准溶液色谱图 4.3样品色谱图 某气泡饮料的色谱图如图5所示： [mV] 图5气泡饮料样品色谱图 某维生素饮料的色谱图如图6所示： 图6维生素饮料样品色谱图 4.4结果计算 ：2pxV公式： X=· m×1000 式中： X——试样中待测组分含量，单位为克每千克(g/kg)； p—由标准曲线得出的试样液中待测物的质量浓度，.9单位为毫克每升(mg/L)； V—-试样定容体积，单位为毫升(mL)； m—-试样质量，单位为克(g)； 1000——由 mg/kg 转换为 g/kg 的换算因子。 结果保留3位有效数字。 4.5实际样品测试结果 取某饮料样品，按照样品前处理步骤，对处理好的样品进行上上测定，测试结果未检出。 【仪电分析】食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定               液相色谱法苯甲酸、山梨酸和糖精钠是常用的食品添加剂，也是衡量食品卫生质量的重要指标。苯甲酸、山梨酸具有防腐保鲜的作用，糖精钠是合成甜味剂，甜度比蔗糖甜300-500倍。GB2760-2016《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》对这三者的添加范围和限量都有明确的规定，超范围或者超限量使用都是违法的。GB5009.28-2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》对其检测方法做了规定，有高效液相色谱法和高效气相色谱法，其中高效液相色谱法为第一法仲裁法被广泛应用。本方案参考GB 5009.28-2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》中第一法：液相色谱法，该法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定。 一、方法原理样品经水提取，高脂肪样品经正己烷脱脂、高蛋白样品经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，采用液相色谱分离、紫外检测器检测，外标法定量。 二、主要仪器及试剂a. 高效液相色谱仪：LC220，配备紫外检测器； b.自动进样器：AS2000；c.色谱柱：C18柱，4.6 mm×250 mm，粒径为5 µm； d.分析天平；e.涡旋振荡器；f.离心机；g.超声波发生器；h.苯甲酸、山梨酸、糖精钠水溶液混合溶液：ρ=1000mg/L；i.氨水；j.亚铁氰化钾；k.乙酸锌；l.无水乙醇；m.正己烷；n.甲醇：色谱纯；o.乙酸铵：色谱纯；p.甲酸：色谱纯。三、实验方法3.1 参考色谱条件色谱柱C18（250mm×4.6mm×5μm）流  速1mL/min波  长230nm柱  温28℃或室温进样量10μL流动相甲醇+乙酸铵溶液=5+95。注：当存在干扰峰或需要辅助定性时，可以采用加入甲酸的流动相来测定，如流动相：甲醇+甲酸-乙酸铵溶液=8+92。3.2 标准系列的制备3.2.1 苯甲酸、山梨酸和糖精钠（以糖精计）混合标准中间溶液（200mg/L）)：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准储备溶液各10.0mL于50mL容量瓶中，用水定容。于4 ℃贮存，保存期为3个月。 3.2.2 苯甲酸、山梨酸和糖精钠（以糖精计）混合标准系列工作溶液：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸和糖精钠混合标准中间溶液0mL、0.05mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL和10.0mL，用水定容至10mL，配制成质量浓度分别为 0 mg/L、1.00 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0mg/L、100mg/L和200mg/L的混合标准系列工作溶液。临用现配。 3.3 样品制备3.3.1 样品准备取多个预包装的饮料、液态奶等均匀样品直接混合；非均匀的液态、半固态样品用组织匀浆机匀浆；固体样品用研磨机充分粉碎并搅拌均匀；奶酪、黄油、巧克力等采用50 ℃~60 ℃加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。取其中的200g装入玻璃容器中，密封，液体试样于4 ℃保存，其他试样于-18 ℃保存。3.3.2 试样提取a. 一般性试样准确称取约2 g（精确到0.001 g）试样于50 mL具塞离心管中，加水约25 mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液2mL和乙酸锌溶液2mL，混匀，于8000r/min离心5min，将水相转移至50mL容量瓶中，于残渣中加水20mL，涡旋混匀后超声5min，于8000r/min离心5 min ，将水相转移到同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过0.22 pm滤膜，待液相色谱测定。注：碳酸饮料、果酒、果汁、蒸馏酒等测定时可以不加蛋白沉淀剂。b. 含胶基的果冻 、糖果等试样准确称取约2 g（精确到0.001 g）试样于50 mL具塞离心管中，加水约25 mL，涡旋混匀，于70℃水浴加热溶解试样，于50℃水浴超声20 min，之后的操作同2.2.1。c. 油脂、巧克力、奶油、油炸食品等高油脂试样准确称取约2 g（精确到0.001 g）试样于50 mL具塞离心管中，加正已烷10 mL，于60 ℃水浴加热约5 min，并不时轻摇以溶解脂肪，然后加氨水溶液（1+99）25 mL，乙醇1 mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声20 min，冷却至室温后，加亚铁氰化钾溶液2 mL和乙酸锌溶液2 mL,混匀，于8 000 r/min 离心5 min，弃去有机相，水相转移至50 mL容量瓶中，残渣同3.3.2（a）再提取一次后测定。四、实验结果4.1 标准工作曲线苯甲酸、山梨酸和糖精钠的标准工作曲线如图1-图3所示，其中苯甲酸线性回归方程为：y=27240.5x，相关系数r为0.9998。山梨酸线性回归方程为：y=53259.5x，相关系数r为0.9995。糖精钠线性回归方程为：y=17221x，相关系数r为0.9998。  图1 苯甲酸标准工作曲线图2 山梨酸标准工作曲线 图3 糖精钠标准工作曲线4.2 混合标准溶液图谱浓度为100mg/L的混合标准溶液的色谱图如图4所示： 图4 混合标准溶液色谱图4.3 样品色谱图某气泡饮料的色谱图如图5所示：图5 气泡饮料样品色谱图某维生素饮料的色谱图如图6所示：图6 维生素饮料样品色谱图4.4 结果计算公式：式中：X——试样中待测组分含量，单位为克每千克（g/kg）；ρ——由标准曲线得出的试样液中待测物的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（g）；1 000——由mg/kg转换为g/kg的换算因子。结果保留3位有效数字。 4.5 实际样品测试结果取某饮料样品，按照样品前处理步骤，对处理好的样品进行上机测定，测试结果未检出。