液体中无菌取样检测方案(微生物检测)

智能文字提取功能测试中

简介 2020年1月6日 关键词或短语：无菌检测，隔膜取样 Sterisart@ Sterisart@的隔膜可确保从封闭系统无菌检测装置中进行可靠取样 Jahnavi Ambekal Puttana， Arjun Simha Jayanagar Prahlada'， Eric C. Arakel， Elke Rungeling1 1.印度班加罗尔赛多利斯斯泰帝生物技术有限公司研发部 2.德国哥廷根赛多利斯实验室仪器有限责任公司产品管理实验室必需品微生物学 3.德国哥廷根赛多利斯斯泰帝生物技术有限公司研发部 通讯作者 电子邮箱： eric.arakel@sartorius.com 摘要 在这项研究中，我们评估了配有隔膜的Sterisart@封闭系统无菌检测装置用于样品反复无菌提取的性能。结果表明，即使在超过100次重复的隔膜取样操作(远远超过任何可预见的取样要求)之后，隔膜仍然完好无损，并且这些容器中包含的生长培养基仍然无菌。 Sterisart@隔膜使接种和取样变得简单，并使传统封闭系无无菌检测与快速检测方法得以结合。 药品通常是根据严格的GMP指南生产的。尽管有这些严格的规范，作为批量放行前的保险措施，所有药品都要经过严格的无菌检测，以确定是否存在活微生物。至关重要的是，应在患者接触到受污染的产品之前，检测到其中的病原微生物，如细菌、病毒和真菌。对于患者和制药公司来说，向市场投放不达标药物并造成严重后果的情况仍有罕见的事例。 按照国际药典(USP<71>、EP 2.6.1、JP 4：06)规定的监管要求进行无菌检测。无菌检测可通过直接接种|转移或膜过滤进行，其中膜过滤是优选方法。只有在产品特性不允许进行膜过滤的情况下，才通过直接接种对产品进行无菌测试。膜过滤法通常依赖于一个封闭过滤装置，该装置中包含一个孔径不超过 0.45 um的膜。已有研究明确证明该膜可以截留微生物。该系统的其他组件包括一个驱动样品穿过膜过滤器的合适压力源(如蠕动泵)、一种合适的膜冲洗液，以及生长|培养基。这种封闭式设置通常符合洁净室要求，以便消除所有污染风险以及由此产生的假阳性结果。一旦样品过滤完成，密闭系统开始培养，通常会培养14天，并以浑浊度作为微生物污染的指标对其进行考察。 Sterisart@容器是一种基于膜过滤法的无菌检测封闭系统。该封闭系统不需要对膜过滤器进行物理操作，从而可降低二次污染和假阳性的风险。 然而，在既定的14天培养后，当生长培养基因微生物生长而变得浑浊时，样品提取则成为一个先决条件。如果检测到微生物生长，则确定微生物的身份和污染源，并宣布无菌试验无效，然后重复试验。过滤后或培养期间，也可能需要提取无菌样品或补充无菌酶，例如停用可能导致假阴性的抗生素。 经过滤的试验样品出现的沉淀，或由于化合物的固有特性引起的不利颜色变化，也可能使生长培养基变混浊，这甚至会出现在规定温度下培养之前。这涉及到无菌试验的判定及放行批次的认证；该批次可能需要通过从容器中提取样品及随后的传代培养进行附加测试。 在传统无菌测试系统中，样本提取需要刺穿或切割通向容器入口的管道，然后在不损害容器或其内容物完整性的情况下，尝试小心提取样本。通过切割管道提取样品，则无法重复取样。使用其他方法进行多次取样会损害封闭系统，从而增加污染风险。 Sterisart@隔膜旨在帮助生长促进试验培养期间的重复取样。在本报告中，我们研门表明，通过Sterisart@隔膜进行多次取样(超过100次)不会导致系统污染，该重复次数超过了无菌取样的任何可能需求。 使用隔膜的原因： a) 培养后，微生物生长会使生长培养基变得浑浊，因此，作为根本原因分析的一部分，必须对微生物进行鉴定。 b) 该产品在培养前即使生长培养基变混浊，则需要进行传代培养|稀释。 c) 通过快速检测方法抽取样本以检测微生物污染。 ( d) 样品中需补充作用剂，以抵消受试产品的抗菌成分。 ) 耗材 胰蛋白大豆肉汤(TSB)(Gila/BD)、硫乙醇酸盐液体培养基(FTM)(Gila/BD)、TSB(Merck)、FTM(Merck)、胰蛋白大豆琼京(TSA)(Merck)、玻璃反应管-30mL(Borosil)、针头-0.90x70 mm、2OGx2%(Sterican-B.Braun)、注射器-FLuer(Omnifix-B.Braun)。 设备 Sterisart@泵，培养箱(赛多利斯斯泰帝生物技术有限公司)，Combisart@三联过滤支架(赛多利斯斯泰帝生物技术有限公司)，直排泵(赛多利斯斯泰帝生物技术有限公司)。 SterisartNF无菌试验系统 膜过滤： 在隔膜取样试验中，对来自三种隔膜类型的分别十个Sterisart料筒(总共30个)进行了分析。 十个料筒中有一个(来自每种Sterisart@容器类型)作为阴性对照(即，直到试验第24天才从该容器中提取样品)。 在无菌条件下，在生物安全柜中往Sterisart@培养料筒中灌装生长培养基。将两个Sterisart@料筒放置在泵支架上，并使Sterisart@管路系统穿过泵头。使用封闭的翼形螺母塞密封每个Sterisart@料筒的出口。两个无菌通风过滤器不加盖。打开Y型分配器出口处的黄色管夹，并关闭相邻的白色管夹。将双针金属钉插入装有FTM的瓶子中，并开启Sterisart@泵。将预定体积(75ml)的培养基转移到第一个料筒中后，关闭泵。打开Y型分配器出口处的白色管夹，并关闭相邻的黄色管夹。将双针金属钉插入装有TSB的瓶子中，并开启Sterisart@泵。将相似体积(75ml)的培养基转移到第二个料筒中。使用培养料筒入口上方的两个夹具密封管道，从而切断管路。请参考我们的 Sterisart@ NF gamma 用户手册，以便了解所述流程的图形描述。 将含有TSB的Sterisart@料筒在22.5°℃下培养24天。其中TSB是用于检测低发病率真菌和好氧细菌的推荐生培养基。将含有FTM的SterisartQ料筒在32.5℃下培养24天。其中FTM是用于培养需氧、微需氧和厌氧微生物的推荐生长培养基 隔膜取样： 无菌条件下，在生物安全柜中从Sterisart@料筒中提取样品。从Sterisart@培养料筒的顶部、中部和底部提取三个样品，每个样品 100 ul， 每天提取两次，共持续17天(3×2×17=102个样品)。将提取的样品转移到含有无菌液体培养基、FTM和TSB的玻璃反应管中。含有TSB的小瓶在22.5℃下培养 14天，含有FTM的小瓶在 32.5℃下培养14天。通过对每个Sterisart@装置和相应的提取样品进行拍照，以便记录结果。 微生物计数： 使用放置在无菌赛多利斯Combisart@过滤装置中的黑色网格膜过滤器，并连接至直排泵，以进行最后的检查。在Sterisart@料筒中培养24天后，将60-70mlTSB填充到漏斗中，并通过黑色薄膜过滤器过滤。使用无菌镊子将过滤器转移到TSA板上，并将该板在36℃下培养3-5天。然后检查这些板是否有微生物污染。 8. 管道 结果与讨论 在102次隔膜穿孔并反复提取样本后，确定所有Sterisart@料筒(3×9个含有FTM， 3×9个含有TSB；第10个料筒含有FTM和TSB作为各自的对照)均为无菌，且在24天后未检测到微生物污染。(图1) 同样，所提取的样品也是无菌的，没有微生物生长，这表明Sterisart@隔膜可以实现高效和高度可靠的无菌取样。(图2) 图1：重复提取样品后无微生物污染。Sterisart@16466 GSD 版本填充了TSB(A和B)或FTM(C和D)，并分别在22.5℃和32.5℃下培养24天期间的代表性图像。阴性对照显示在A和C中。 为了进行样品提取，B和D中的料筒被穿孔102次。 图2：从Sterisart@16466 GSD 提取的样品在玻璃瓶中培养后没物微生物污染。将样品接种到含有TSB(上层板)和FTM(下层板)的玻璃瓶中，分别在22.5°C和32.5°C下生长14天。 当隔膜被多次刺穿或使用了不合适的针型时，可能会发生“结晶”的情况。在某些Sterisart@料筒中，仅在36次穿孔后就观察到微小颗粒。24天后在黑色薄膜过滤器上收集这些颗粒，并监测其在TSA板上形成菌落的能力。这些颗粒即使在培养五天后也没有表现出任何生长迹象，这表明这些颗粒在本质上不具生物活性。根据其形态，我们得出结论，这些惰性颗粒是在注射器针头反复穿刺过程中从隔膜上剪下的橡胶碎片。这些碎片不会影响无菌试验的效果，并且几乎不会落入在生长培养基中。 我们建议，只有在受控环境下拔下无菌通风口(即无盖)后，才能进行隔膜取样。 我们的结果表明， Sterisart@料筒即使在连续提取102个样品后，仍然是一个封闭且无菌的装置。 结论 总而言之，我们证明了Sterisart@隔膜的强大性能，即使在提取了100多个样品后仍能保持完整的无菌环境。 在无菌检测产品中，防腐剂和抗菌剂的存在在很大程度上阻碍了依赖直接接种的快速检测方法的采用。此类产品的膜过滤及随后的膜冲洗可减少无菌检测期间出现假阴性的风险。我们通过膜过滤实现大体积分析，并实现样品提取，从而为用户提供了将封闭系统无菌检测与快速无菌检测方法相结合的能力。 然而，某些生长缓慢的厌氧菌很难用一些快速无菌方法检测出来。鉴于隔膜取样不会影响封闭系统无菌检测的完整性，我们为客户提供了一种可能性，既能快速无菌检测取样，同时又可在规定的14天培养期内重新培养并进行无菌检测。 HIIK FRONT 受 SARTTRIUS STERISARTUNIVERSAL 销售与服务联系方式 更多联系信息，请访问 www.sartorius.com.cn 赛多利斯(上海)贸易有限公司 邮箱lab.cn@sartorius.com 服务热线 400 920 9889|800 820 9889 上海北京上海市浦东新区盛荣路 388北京市顺义区空港工业区 B弄百佳通产业园3号楼区裕安路 33号， 1013007-11层，200120电话+86 10 8042 6300 电话+86 21 6066 6100苏州广州 苏州市虎丘区科技城锦峰路广州市越秀区水荫路 117 号 158 号 101park-28 幢201，1105单元， 510075 215163电话+8620 3761 7284 电话+86512 6616 0490 成都西安成都市上东大街 246号新良西安市和平路 118 号和平银大厦2406室， 610012座1107室， 710001电话+86 28 8666 6877电话 +86 29 87512305 ( 技木规格如有变更，恕不另行通知。 ) ( 赛多利斯保留最终解释权和修改权。 ) ( 版本02|2022 ) 了解更多： sartorius.com Overview药品通常是根据严格的GMP指南生产的，作为批量放行前的保险措施，所有药品都要经过严格的无菌检测，以确定是否存活微生物。Sterisart®是一种基于膜过滤法的无菌检测封闭系统。该封闭系统不需要对膜过滤器进行物理操作，从而可降低二次污染和假阳性的风险。Download本篇《Sterisart®的隔膜可确保从封闭系统无菌检测装置中进行可靠取样》应用说明评估了配有隔膜的Sterisart® 封闭系统无菌检测装置用于样品反复无菌提取的性能。结果表明，即使在超过100 次重复的隔膜取样操作（远远超过任何可预见的取样要求）之后，隔膜仍然完好无损，并且这些容器中包含的生长培养基仍然无菌。点击下载 获取全文材料和方法耗材胰蛋白大豆肉汤（TSB）（Gila/BD）、硫乙醇酸盐液体培养基（FTM）（Gila/BD）、TSB（Merck）、FTM（Merck）、胰蛋白大豆琼脂（TSA）（Merck）、玻璃反应管 - 30 mL（Borosil）、针头–0.90×70 mm、2OG×2¾（Sterican–B.Braun）、注射器–F Luer（Omnifix–B.Braun）。设备Sterisart®，培养箱，Combisart® 三联过滤支架，直排泵。Sterisart® NF无菌试验系统16467--------GSD, 16475--------GSD, 16466--------GSD膜过滤在隔膜取样试验中，对来自三种隔膜类型的分别10个Sterisart® 料筒（总共 30 个）进行了分析。10个料筒中有一个（来自每种Sterisart® 容器类型）作为阴性对照。在无菌条件下，在生物安全柜中往Sterisart®培养料筒中灌装生长培养基。将两个Sterisart®料筒放置在泵支架上，并使Sterisart®管路系统穿过泵头。使用封闭的翼形螺母塞密封每个Sterisart®料筒的出口。两个无菌通风过滤器不加盖。打开Y型分配器出口处的黄色管夹，并关闭相邻的白色管夹。将双针金属钉插入装有FTM的瓶子中，并开启Sterisart®泵。将预定体积（75 ml）的培养基转移到第一个料筒中后，关闭泵。打开Y型分配器出口处的白色管夹，并关闭相邻的黄色管夹。将双针金属钉插入装有TSB的瓶子中，并开启Sterisart®泵。将相似体积（75 ml）的培养基转移到第二个料筒中。使用培养料筒入口上方的两个夹具密封管道，从而切断管路。将含有TSB的Sterisart®料筒在 22.5 °C下培养 24 天。其中TSB是用于检测低发病率真菌和好氧细菌的推荐生培养基。将含有FTM的Sterisart®料筒在 32.5 °C下培养 24 天。其中FTM是用于培养需氧、微需氧和厌氧微生物的推荐生长培养基。隔膜取样无菌条件下，在生物安全柜中从Sterisart®料筒中提取样品。从Sterisart®培养料筒的顶部、中部和底部提取三个样品，每个样品 100 μl，每天提取两次，共持续 17 天（3×2×17=102 个样品）。将提取的样品转移到含有无菌液体培养基、FTM和TSB的玻璃反应管中。含有TSB的小瓶在 22.5 °C下培养 14 天，含有FTM的小瓶在 32.5 °C下培养 14 天。通过对每个Sterisart®装置和相应的提取样品进行拍照，以便记录结果。微生物计数使用放置在无菌Combisart®过滤装置中的黑色网格膜过滤器，并连接至直排泵，以进行最后的检查。在Sterisart®料筒中培养 24 天后，将 60 - 70 ml TSB填充到漏斗中，并通过黑色薄膜过滤器过滤。使用无菌镊子将过滤器转移到TSA板上，并将该板在 36 °C下培养 3 - 5 天。然后检查这些板是否有微生物污染。结果与讨论在 102 次隔膜穿孔并反复提取样本后，确定所有Sterisart® 料筒（3 × 9 个含有FTM，3 × 9 个含有TSB；第 10 个料筒含有FTM和TSB作为各自的对照）均为无菌，且在 24 天后未检测到微生物污染。（图1）同样，所提取的样品也是无菌的，没有微生物生长，这表明Sterisart®隔膜可以实现高效和高度可靠的无菌取样。（图2）图1：重复提取样品后无微生物污染。Sterisart® 16466 GSD 版本填充了TSB（A和B）或FTM（C和D），并分别在 22.5 °C和 32.5 °C下培养 24 天期间的代表性图像。阴性对照显示在A和C中。为了进行样品提取，B和D中的料筒被穿孔 102 次。图2：从Sterisart®16466 GSD 提取的样品在玻璃瓶中培养后没有微生物污染。将样品接种到含有TSB（上层板）和FTM（下层板）的玻璃瓶中，分别在22.5° C和32.5° C下生长 14 天。当隔膜被多次刺穿或使用了不合适的针型时，可能会发生“结晶”的情况。在某些Sterisart®料筒中，仅在 36 次穿孔后就观察到微小颗粒。24 天后在黑色薄膜过滤器上收集这些颗粒，并监测其在TSA板上形成菌落的能力。这些颗粒即使在培养五天后也没有表现出任何生长迹象，这表明这些颗粒在本质上不具生物活性。根据其形态，我们得出结论，这些惰性颗粒是在注射器针头反复穿刺过程中从隔膜上剪下的橡胶碎片。这些碎片不会影响无菌试验的效果，并且几乎不会落入在生长培养基中。结果表明，Sterisart® 料筒即使在连续提取 102 个样品后，仍然是一个封闭且无菌的装置。结论总而言之，该研究证明了Sterisart®隔膜的强大性能，即使在提取了 100 多个样品后仍能保持完整的无菌环境。在无菌检测产品中，由于防腐剂和抗菌剂的存在，在很大程度上阻碍了依赖直接接种的快速检测方法的采用。此类产品的膜过滤及随后的膜冲洗可减少无菌检测期间出现假阴性的风险。通过膜过滤实现大体积分析，并实现样品提取，从而为用户提供了将封闭系统无菌检测与快速无菌检测方法相结合的能力。