斑马鱼中呼吸代谢及行为分析检测方案(动物代谢检测)

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Beijing Ecotech Science and Technology Ltd.生态-农业-健康 (Ecology，Agriculture， Health) Beijing Ecotech Science and Technology Ltd.生态-农业-健康 (Ecology，Agriculture， Health) 斑马鱼呼吸代谢及行为分析技术在生态毒理学领域的应用 关键词：斑马鱼、能量代谢、游泳能力、行为分析、生态毒理学、易科泰 作为国际上广受欢迎的模式动物，斑马鱼除了易于养殖、性成熟周期短、产卵量大等特点之外，还具有受精卵体外发育、胚胎透明、易进行化合物的高通量筛选等诸多独特的优势，并且人类和斑马鱼之间生理和遗传上均有高度同源性。 此外，传统应用啮齿类动物的毒性测试受到越来越严苛的实验动物福利伦理规定的挑战，而应用培养细胞的体外测试方法由于缺少生物体的复杂性限制了其实验数据的意义。因此斑马鱼为实验动物的研究近年来越来越受到毒理学领域科研工作者的重视。不仅在探究污染物对水生生物的毒性效应及其作用机制中发挥了重要作用，相关的数据还有助于评价污染物对哺乳动物乃至人类的毒作用(孙立伟等，2018)。 引自(Bambino and Chu， 2017) 易科泰生态技术公司提供斑马鱼呼吸代谢测量与行为观测全面解决方案，能够在增塑剂、农药、重金属、芳香族化合物、药物等环境污染物对斑马鱼的毒理效应和毒性机制研究中，为毒理学科研工作者提供必要的生理和行为性状数据。涉及的具体仪器设备、功能及关键参数、应用方向如下： 模块 功能 关键参数 应用方向 鱼卵、胚胎、幼鱼高通量呼吸代谢测量 24+通道高通量测量 耗氧率(MO2/VO2) 环境污染物对鱼、成鱼的亚致死效应； 不同污染物暴露方式毒理效应的比较； 环境污染物毒性 成鱼呼吸代谢测量 4通道/8通道、自动长期监测 耗氧率(MO2/VO2)、标准代谢率 SMR 高通量视频跟踪及行为分析 24+通道高通量分析 速度、加速度、移动距离、活动/非活动时间和比例、运动轨迹 北京易科泰生态技术有限公司 游泳能力 自动化测量、分析 临界游泳速度 Ucrit 机制研究 游泳训练 游泳呼吸同步测定 自动化测量、分析 临界游泳速度 Ucrit、耗 游泳训练 氧率(MO2/VO2) 活动代谢率(AMR) 模块1.鱼卵、胚胎、幼鱼高通量呼吸代谢测量 斑马鱼鱼卵、胚胎、幼鱼呼吸代谢测量由内置氧气感应贴片的24孔板、氧气测量主机、密封配件等组成，多个氧气测量主机可串联组成最多240个通道的高通量测量系统。 Oxygen [%air saturation] vs time [min] A1 81 应用案例：6PPD(轮胎抗氧化剂)及6PPD 醌对斑马鱼幼鱼的毒理效应 6PPD 是在汽车轮胎和多种橡胶制品中广泛使用的抗氧化剂。挪威诺德大学的研究人员调查了6PPD 及 6PPD醌对斑马鱼的急性毒性及对其形态、游泳行为、心率和耗氧率的影响。发现环境相关浓度不会造成显著的毒性，而亚致死浓度则会引起发育、行为和心脏毒性(Varshney et al.， 2022). 耗氧率的测定采用了高通量呼吸代谢测量系统：在对溶解氧传感器进行两点校准后，将斑马鱼幼鱼放入微孔中，每个孔两条，于28℃恒温条件下测定。发现暴露在 PPD 及其及 96h的斑马鱼幼鱼氧气消耗相比于对照组有所升高，并存在剂量和时间依赖性。 模块2.成鱼呼吸代谢测量 斑马鱼幼鱼及成鱼呼吸代谢测量系统采用了经典的间歇式(Intermittent flow/stop-flow)测量法，兼具高时间分辨率和长期监测的特点。针对斑马鱼体长短、体重轻、耗氧量低等特点，采用了小型的呼吸室、水泵及非接触式的光学氧气传感器，确保获得可靠的耗氧曲线和耗氧率数据。系统具备自动控制、测量和分析的功能，放入斑马鱼样品、设置间歇测量各阶段的时间后，系统即可自动运行和计算耗氧率，研究人员也可借助配套软件计算标准代谢率(SMR)等数据。 易科泰公司提供同时自主集成的斑马鱼呼吸测量系统，可自动切换小型水泵的开闭状态，实现了自动化间歇式测量。溶解氧监测采用了荧光光纤氧气传感器，具备高灵敏度和高分辨率，并且易安装、零维护。 模块3.高通量视频跟踪及行为分析 斑马鱼视频跟踪和行为分析系统由高清高帧频工业相机、斑马鱼行为分析软件、斑马鱼活动室/池等组成。先录制高质量斑马鱼活动视频，再在计算机上使用专业行为分析软件对 北京易科泰生态技术有限公司 视频中的斑马鱼进行分析，获得其随时间变化的行为轨迹(X坐标和Y坐标；单条斑马鱼可做3D跟踪，包括X、Y、Z坐标)，最后自动计算获得数十种行为学参数。基于机器视觉的斑马鱼行为分析系统，能够对24孔、48孔、96孔板中的斑马鱼进行高通量行为采集和分析，使研究者轻松获得大量行为数据。 应用案例： SDHI类杀菌剂神经毒性机制研究 啶酰菌胺属于线粒体呼吸链中琥珀酸辅酶Q还原酶抑制剂(SDHI)，是一类主要用于经济作物的广谱杀真菌剂。因其降解缓慢，常在水样甚至水生生物中被发现。中国农业大学的研究人员为探究啶酰菌胺的神经毒性机制，测定了暴露处理后的斑马鱼幼鱼和成鱼的行为响应、组织病理学、转录组学、生化参数和基因表达。发现啶酰菌胺可能通过损伤正常的视觉和神经系统功能影响神经行为表现(Qian，2021)。 鱼类行为测试是评估环境污染物的神经毒性的有效手段。本研究中使用了视频跟踪及行为分析系统，分别对慢性暴露在不同浓度啶酰菌胺下幼鱼和成鱼的活动过程进行了记录，记录前使其适应应环境10min，持续记录 15min 后，对视频文件进行分析，获得了包括速度、加速度、移动距离和活动时间等行为参数。发现亚致死浓度啶酰菌胺慢性暴露下的幼鱼以上4个行为参数均整体降低，并呈时间剂量依赖性。而暴露在高浓度(1.0mg/L)啶酰菌胺下21天的成鱼平均速率、加速度受到抑制，但活动时间和移动距离显著增加。因此，啶酰菌胺慢性暴露抑制了斑马鱼幼鱼和成鱼的运动能力。 北京易科泰生态技术有限公司 模块4.游泳能力 斑马鱼游泳能力研究测试系统为一站式方案，包括斑马鱼专用小型游泳室和自动化水流速度控制、校准的所有软硬件。系统提供适合斑马鱼游泳匹配的高精度控制水流，水流调节速度为0.7-50cm/s。 该系统能够实现水流速度的校准、转换、校正和控制，单位和方式任选(如以BL/sec 为单位的游泳速度)，可对 Solid Blocking 效应(斑马鱼自身阻碍水流引起的水流速度变化)进行校正，并且能够创建自动化的用户自定义程序。 模块5：游泳呼吸同步测定 北京易科泰生态技术有限公司 Beijing Ecotech Science and Technology Ltd. 生态-农业-健康 (Ecology， Agriculture，Health) 游泳呼吸同步测定系统是在模块4的基础上添加了斑马鱼间歇式呼吸测量功能，从而实现了游泳速度模拟和活动代谢率测定的双重功能。 应用案例：多环芳烃不同暴露方式的亚致死效应研究 多环芳烃(PAHs)是普遍存在的环境污染物，它能够引起多种鱼类的发育毒性，但对成年鱼类急性毒性的研究较少。为此，加拿大萨斯喀彻温大学毒理学中心的研究人员对斑马鱼进行了两种方式的急性暴露性―腹腔注射和水环境暴露 (aqueous exposure)，并测定了心脏功能、代谢率和有氧能力(Gerger， 2015)。后两者使用了游泳呼吸同步测定系统。 该系统包括170mL 的小型泳道、20L的水浴箱和呼吸代谢测量模块，使用前对溶解氧传感器进行两点校准，并设定最低流速使斑马鱼适应 90min。之后以每 20min 递增 0.077m/s的增量提高流速，直到斑马鱼力竭(停止游泳最少2s)，最后根据公式计算临界游泳速度 Ucrit。 在测定 Ucrit 过程中，采用间歇式呼吸测量法，设定测量程序为“1min 交换-4min 等待-5min 测量”直到氧气含量低于90%空气饱和度。根据耗氧率(MO2)一游泳速度的非线性曲线推导流速为零时的耗氧率，即为标准代谢率 SMR。游泳速度最高时定义为活动代谢率AMR。根据代谢率数据和临界游泳速度计算了相对代谢空间(F-AS)和单位距离能耗(COT). 数据表明随着游泳速度的增大，所有处理组 MO2 显著增大， OCT 显著降低。 Ucrit 无显著差异(未展示)。不同剂量的两种方式暴露后的斑马鱼 SMR 显著升高， AMR 没有显著变化， F-AS 显著降低。以上结果表明两种方式的多环芳烃暴露使斑马鱼基础代谢提高以应对毒物暴露并且有氧能力减弱。综合其他方面的数据，发现多环芳烃急性暴露对成年斑马鱼有显著的亚致死效应，尤其会对斑马鱼的有氧能力和心肺功能产生负面影响。 Control ( 参考文献 ) 1.孙立伟，靳远祥，傅正伟，等.基于斑马鱼的水生生态毒理学实验教学体系的构建[].生态毒理学报，2018，13(2)：6. 2.Bambino，K.， and Chu， J.(2017). Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. In CurrentTopics in Developmental Biology， (Elsevier)， pp. 331-367. 3. Gerger， C.J. (2015). Comparison of the acute effects of benzo-a-pyrene on adult zebrafish(Danio rerio) cardiorespiratory function following intraperitoneal injection versus aqueousexposure. Aquatic Toxicology 165：19-30. ( 4. Qian， L . ( 2021). E nvironmentally relevant c oncentrations o f b oscalid e xposure a ffects the neurobehavioral response o f zebrafish b y disrupting v i sual and nervous sy s tems. Journal of Hazardous Materials 404， 124083. ) 5. Varshney， S.， Gora， A.H.， Siriyappagouder， P.， Kiron， V.， and Olsvik， P.A.(2022). Toxicological 北京易科泰生态技术有限公司 作为国际上广受欢迎的模式动物，斑马鱼除了易于养殖、性成熟周期短、产卵量大等特点之外，还具有受精卵体外发育、胚胎透明、易进行化合物的高通量筛选等诸多独特的优势，并且人类和斑马鱼之间生理和遗传上均有高度同源性。此外，传统应用啮齿类动物的毒性测试受到越来越严苛的实验动物福利伦理规定的挑战，而应用培养细胞的体外测试方法由于缺少生物体的复杂性限制了其实验数据的意义。因此斑马鱼为实验动物的研究近年来越来越受到毒理学领域科研工作者的重视。不仅在探究污染物对水生生物的毒性效应及其作用机制中发挥了重要作用，相关的数据还有助于评价污染物对哺乳动物乃至人类的毒作用（孙立伟等，2018）。 易科泰生态技术公司提供斑马鱼呼吸代谢测量与行为观测全面解决方案，能够在增塑剂、农药、重金属、芳香族化合物、药物等环境污染物对斑马鱼的毒理效应和毒性机制研究中，为毒理学科研工作者提供必要的生理和行为性状数据。涉及的具体仪器设备、功能及关键参数、应用方向如下： 模块1. 鱼卵、胚胎、幼鱼高通量呼吸代谢测量斑马鱼鱼卵、胚胎、幼鱼呼吸代谢测量由内置氧气感应贴片的24孔板、氧气测量主机、密封配件等组成，多个氧气测量主机可串联组成最多240个通道的高通量测量系统。 应用案例：6PPD（轮胎抗氧化剂）及6PPD醌对斑马鱼幼鱼的毒理效应      6PPD是在汽车轮胎和多种橡胶制品中广泛使用的抗氧化剂。挪威诺德大学的研究人员调查了6PPD及6PPD醌对斑马鱼的急性毒性及对其形态、游泳行为、心率和耗氧率的影响。发现环境相关浓度不会造成显著的毒性，而亚致死浓度则会引起发育、行为和心脏毒性(Varshney et al., 2022)。耗氧率的测定采用了高通量呼吸代谢测量系统：在对溶解氧传感器进行两点校准后，将斑马鱼幼鱼放入微孔中，每个孔两条，于28℃恒温条件下测定。发现暴露在PPD及其醌96h的斑马鱼幼鱼氧气消耗相比于对照组有所升高，并存在剂量和时间依赖性。 模块2. 成鱼呼吸代谢测量斑马鱼幼鱼及成鱼呼吸代谢测量系统采用了经典的间歇式(Intermittent flow/stop-flow)测量法，兼具高时间分辨率和长期监测的特点。针对斑马鱼体长短、体重轻、耗氧量低等特点，采用了小型的呼吸室、水泵及非接触式的光学氧气传感器，确保获得可靠的耗氧曲线和耗氧率数据。系统具备自动控制、测量和分析的功能，放入斑马鱼样品、设置间歇测量各阶段的时间后，系统即可自动运行和计算耗氧率，研究人员也可借助配套软件计算标准代谢率(SMR)等数据。    易科泰公司提供同时自主集成的斑马鱼呼吸测量系统，可自动切换小型水泵的开闭状态，实现了自动化间歇式测量。溶解氧监测采用了荧光光纤氧气传感器，具备高灵敏度和高分辨率，并且易安装、零维护。 模块3. 高通量视频跟踪及行为分析斑马鱼视频跟踪和行为分析系统由高清高帧频工业相机、斑马鱼行为分析软件、斑马鱼活动室/池等组成。先录制高质量斑马鱼活动视频，再在计算机上使用专业行为分析软件对视频中的斑马鱼进行分析，获得其随时间变化的行为轨迹（X坐标和Y坐标；单条斑马鱼可做3D跟踪，包括X、Y、Z坐标），最后自动计算获得数十种行为学参数。基于机器视觉的斑马鱼行为分析系统，能够对24孔、48孔、96孔板中的斑马鱼进行高通量行为采集和分析，使研究者轻松获得大量行为数据。 应用案例：SDHI类杀菌剂神经毒性机制研究    啶酰菌胺属于线粒体呼吸链中琥珀酸辅酶Q 还原酶抑制剂（SDHI），是一类主要用于经济作物的广谱杀真菌剂。因其降解缓慢，常在水样甚至水生生物中被发现。中国农业大学的研究人员为探究啶酰菌胺的神经毒性机制，测定了暴露处理后的斑马鱼幼鱼和成鱼的行为响应、组织病理学、转录组学、生化参数和基因表达。发现啶酰菌胺可能通过损伤正常的视觉和神经系统功能影响神经行为表现(Qian, 2021)。鱼类行为测试是评估环境污染物的神经毒性的有效手段。本研究中使用了视频跟踪及行为分析系统，分别对慢性暴露在不同浓度啶酰菌胺下幼鱼和成鱼的活动过程进行了记录，记录前使其适应新环境10min，持续记录15min后，对视频文件进行分析，获得了包括速度、加速度、移动距离和活动时间等行为参数。发现亚致死浓度啶酰菌胺慢性暴露下的幼鱼以上4个行为参数均整体降低，并呈时间剂量依赖性。而暴露在高浓度（1.0mg/L）啶酰菌胺下21天的成鱼平均速率、加速度受到抑制，但活动时间和移动距离显著增加。因此，啶酰菌胺慢性暴露抑制了斑马鱼幼鱼和成鱼的运动能力。 模块4. 游泳能力        斑马鱼游泳能力研究测试系统为一站式方案，包括斑马鱼专用小型游泳室和自动化水流速度控制、校准的所有软硬件。系统提供适合斑马鱼游泳匹配的高精度控制水流，水流调节速度为0.7 - 50 cm/s。该系统能够实现水流速度的校准、转换、校正和控制，单位和方式任选（如以BL/sec为单位的游泳速度），可对Solid Blocking效应（斑马鱼自身阻碍水流引起的水流速度变化）进行校正，并且能够创建自动化的用户自定义程序。 模块5：游泳呼吸同步测定    游泳呼吸同步测定系统是在模块4的基础上添加了斑马鱼间歇式呼吸测量功能，从而实现了游泳速度模拟和活动代谢率测定的双重功能。 应用案例：多环芳烃不同暴露方式的亚致死效应研究    多环芳烃（PAHs）是普遍存在的环境污染物，它能够引起多种鱼类的发育毒性，但对成年鱼类急性毒性的研究较少。为此，加拿大萨斯喀彻温大学毒理学中心的研究人员对斑马鱼进行了两种方式的急性暴露——腹腔注射和水环境暴露（aqueous exposure），并测定了心脏功能、代谢率和有氧能力(Gerger, 2015)。后两者使用了游泳呼吸同步测定系统。该系统包括170mL的小型泳道、20L的水浴箱和呼吸代谢测量模块，使用前对溶解氧传感器进行两点校准，并设定最低流速使斑马鱼适应90min。之后以每20min递增0.077m/s的增量提高流速，直到斑马鱼力竭（停止游泳最少2s），最后根据公式计算临界游泳速度Ucrit。在测定Ucrit过程中，采用间歇式呼吸测量法，设定测量程序为“1min交换-4min等待-5min测量”，直到氧气含量低于90%空气饱和度。根据耗氧率（MO2）—游泳速度的非线性曲线推导流速为零时的耗氧率，即为标准代谢率SMR。游泳速度最高时定义为活动代谢率AMR。根据代谢率数据和临界游泳速度计算了相对代谢空间（F-AS）和单位距离能耗（COT）。数据表明随着游泳速度的增大，所有处理组MO2显著增大，OCT显著降低。Ucrit无显著差异（未展示）。不同剂量的两种方式暴露后的斑马鱼SMR显著升高，AMR没有显著变化，F-AS显著降低。以上结果表明两种方式的多环芳烃暴露使斑马鱼基础代谢提高以应对毒物暴露并且有氧能力减弱。综合其他方面的数据，发现多环芳烃急性暴露对成年斑马鱼有显著的亚致死效应，尤其会对斑马鱼的有氧能力和心肺功能产生负面影响。  参考文献 1.孙立伟, 靳远祥, 傅正伟,等. 基于斑马鱼的水生生态毒理学实验教学体系的构建[J]. 生态毒理学报, 2018, 13(2):6.2.Bambino, K., and Chu, J. (2017). Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. In Current Topics in Developmental Biology, (Elsevier), pp. 331–367.3.Gerger, C.J. (2015). Comparison of the acute effects of benzo-a-pyrene on adult zebrafish (Danio rerio) cardiorespiratory function following intraperitoneal injection versus aqueous exposure. Aquatic Toxicology 165: 19-30.4.Qian, L. (2021). Environmentally relevant concentrations of boscalid exposure affects the neurobehavioral response of zebrafish by disrupting visual and nervous systems. Journal of Hazardous Materials 404, 124083.5.Varshney, S., Gora, A.H., Siriyappagouder, P., Kiron, V., and Olsvik, P.A. (2022). Toxicological effects of 6PPD and 6PPD quinone in zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials 424, 127623.