肿瘤免疫微环境中细胞空间距离分布量化检测方案(细胞定量分析)

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研究现状|研究挑战|研究手段|肿瘤免疫多色案例介绍|一站式突破解决方案|应用案例解析-文章分享 TISSUEGNOSTICS ：PRECISION THATINSPIRES TissueFAXS Cytometry 肿瘤免疫微环境解决方案 研究现状 肿瘤微环境(TME)是一个复杂的综合系统，不仅包含肿瘤细胞，还包括基质细胞，炎症细胞，脉管系统和细胞外基质等成分，并在肿瘤恶性进展、免疫逃逸和治疗抵抗中发挥重要作用。针对肿瘤微环境的特点开发安全有效的肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的热点之一，2013年Science期刊将其评为当年十大科学突破首位。至今，已有多项批准药物用于不同类型型瘤的治疗，在肿瘤治疗方面取得了令人瞩目的成就。 免疫治疗的成功为无数患者带来福音，然而，免疫治疗仍存在巨大的挑战，比如治疗效果和患者反应的不可预估性，肿瘤免疫治疗抵抗性，以及有效生物标志物缺乏等。肿瘤免疫微环境的复杂性和多样性是影响免疫治疗效果的重要因素之一，特别是近来肿瘤亚微环境研究进一步揭示肿瘤微环境的异质性。因此，对微环境的深入分析与靶向性调控改善免疫治疗的疗效，提供个性化精确治疗，并在揭示新的治疗靶点提供可能。 目前，多种研究手段在刻画肿瘤微环境中发挥作用，但也都存在一定程度的局限性，比如高通量测序技术包括新兴的空间转录组能够揭示细胞的基因组和转录组差异，却无法可视化细胞间的形态特征；流式细胞术能够筛选分析多种细胞型组分，却无法得知细胞的形态与空间位置信息；传统免疫组化能够直观标记某个蛋白的分布与表达，然而标记数量有限；通过连续切片技术虽然可实现多标，但是存在一定的误差，非意义上的单细胞多标。多重免疫荧光技术在肿瘤微环境分析中具有独特优势，能够突破常规免疫荧光抗体种属限制，可实现在一张切片实现多个靶标(≥9色)的标记，并能对细胞的表型，细胞间的原位空间信息，肿瘤微环境的生态群进行精准定量分析，更为有价值的是，2019年《JAMA Oncol》发表的一项研究显示，多重荧光免疫组化技术比目前广泛使用的技术PD-L1IHC、基于下一代测序的肿瘤突变负荷(TMB)和基因表达谱(GEP)具有更高的预测价值。 多重免疫荧光 肿瘤免疫多色案例介绍 肝脏肿瘤组织10+1色免疫荧光染色及光谱拆分 CD68+/CD4-/CD8-巨噬细胞筛选 利用TissueFAXS Cytometry 技术对样本组织中细胞进行特异性筛选。图中展示的是通过组织流式散点图对巨噬细胞的层层筛选识别(左图绿色圈出)，散点图可追溯到图像的每一个单细胞。 首先是CD4与CD8阴性细胞群(左图)，对此细胞群进一步筛选设立Cutoff线得到CD68阳性的巨噬细胞群体(右图)。 肿瘤微环境中免疫细胞空间距离分布量化 利用TissueFAXS Cytometry技术中Classifier功能对组织样本肿瘤与间质区域进行特异性识别，以肿瘤区域为中心，微米级别精度对微环境中免疫细胞的空间分布进行单细胞量化分析。 右侧散点图中不同颜色点数表示距离肿瘤不同距离的免疫细胞浸润数量。该量化数据对于肿瘤免疫分型，免疫细胞浸润分析，药物疗效评估等方向研究具有重要意义。 细胞群社区分析。以10pm范围内的三个及以上细胞作为细胞群，左图中黄色连线展示的是T细胞群体，绿色连线展示的是巨噬细胞群体，白色连线展示的是肿瘤细胞群体。以肿瘤细胞群体为中心，分析其周围T细胞群体和巨噬细胞群体的分布情况，分别定量肿瘤浸润(5pm内)以及附近(5-30um)细胞群体的差异(上图)。 Gate 1：肿瘤附近T细胞群Gate 2：肿瘤浸润T细胞群Gate 3：肿瘤附近M细胞群Gate 4： 肿瘤浸润M细胞群 巨噬细胞与T细胞距离与作用关系 细胞毒性T细胞 辅助T细胞 巨噬细胞 巨噬细胞(绿色)与CD8+T细胞(黄色)以及CD4+T细胞(粉色)的相互作用示意图。通过TissueFAXS Cytometry技术分析巨噬细胞与T细胞的距离关系，并以连线示意，分析结果以直方图形式展示(上图)。大部分CD8+T细胞分布在在巨噬细胞周围，随着距离的提升逐渐数量减少(上左图)，而辅助T细胞在巨噬细胞周围分布较为稀疏，并且在远距离范围内没有T细胞的分布(上右图)。 肿瘤细胞与T细胞距离与作用关系 肿瘤细胞与T细胞距离作用关系分析。识别肿瘤细胞(蓝色)30微米范围内是否有CD8+T细胞，并统计其周围T细胞的数量分布，在左图中以黄色连线展示，统计结果分析展示距离肿瘤细胞30微米以内和30微米以外的CD8+T细胞数量及占比(上左图)，同时距离CD8+T细胞30微米以内和30微米以外的肿瘤细胞数量及占比(上右图)。 Gate 5：癌细胞周围T细胞 Gate 6：远离癌细胞的T细胞Gate 7： 暴露于T细胞 Gate 8：远离T细胞 题目： KDM5B promotes immune evasion by recruiting SETDB1 to silence retroelements单位：耶鲁大学严钦团队 肿瘤会衍生各种策略来逃避免疫监视。针对肿瘤免疫逃逸的免疫疗法，免疫检查点阻断剂已被证实对多种癌症治疗相当有效，例如CTLA-4、PD-1相关药物等。但由于原发性或获得性耐药的原因，这类药物对部分患者治疗无效。为了帮助癌症患者，迫切需要找到能提升免疫疗法效果的新策略。耶鲁大学医学院严钦团队和 Marcus Bosenberg 团队联合在 Nature 杂志发表论文，他们在黑色素瘤小鼠模型中揭示了KDM5B酶导致免疫逃逸的完整过程，这项研究也为无法从目前的免疫疗法中获益的广大癌症患者带来了希望。 文中通过免疫荧光技术作者采用免疫荧光染色的组织样本，结合抗PD-1治疗之前的黑色素瘤样本进行转录组分析，发现对免疫检查点(immune checkpoint bblockade， ICB)有反应的患者KDM5B染色较弱，缺乏可检测到的KDM5B高黑色素瘤细胞，而对ICB有反应的患者有KDM5B高黑色素瘤细胞的主要亚群。这些结果表明KDM5B与肿瘤炎症水平呈负相关，可能是肿瘤免疫抑制剂响应低的生物标志物，靶向KDM5B可能诱导T细胞浸润并克服对ICB的耐药性。进一步研究了KDM5B抑制逆转录元件表达情况，针对RNA水平的验证，使用了抗双链RNA单抗-J2抗体，在KDM5B表达水平低的应答者中检测到比那些KDM5B水平高的无应答者更高水平的双链RNA。 更为重要的是，文中使用了大篇幅的文字对使用TissueGnostics公司全景组织流式定量分析技术进行了详细描述，体现数据的客观与精确性。 拓展阅读： F Finotello， et al. "Next-generation computational tools for interrogating cancer immunity."Nature Reviews Genetics20.14(2019). 题目： Loss of Bcl-6-Expressing T Follicular Helper Cells and Germinal Centers in COVID-19 单位：麻省理工学院，哈佛大学，剑桥大学团队 美国MGH，麻省理工学院和哈佛大学Ragon学院与Brigham妇女医院等七个机构联合，揭示出COVID-19病死患者中没有建立起特异性免疫激活的生发中心，于是患者在应对二次感染时的体液免疫功能就会受到明显影响。研究表明，感染后明显升高的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子，该发现有助于解释新冠肺炎重病患者的发展过程并为疫苗研发者提供启发，同时为理解新冠肺炎二次感染病例的提供突破口。 文中通过大量的免疫荧光技术， 利用TissueGnostics公司全景组织流式定量分析系统在组织原位水平上对11名COVID-19病死者的关键免疫器官，包括脾脏和胸腔淋巴结；并与6名年龄匹配的其他原因死亡者的组织进行定量比较，发现病死的COVID-19患者的免疫器官中并没有建立起生发中心。进一步针对DAPI、CD3、CD8、CD19、Bcl6、ICOS、Foxp3、IgG、CXCR5等靶点抗原进行多重荧光标记，对病毒感染后组织的免疫微环境分析， Bcl-6阳性滤泡辅助性T细胞(Tfh)分化缺陷是导致生发中心未能成功构建的原因。StrataQuest定析分统系统“细胞接触”功能在组织原位上识别单细胞，并且定义3个像素的细胞间的重叠为相互接触，依据这一功能文中发现在生发中心以外的区域仍有T细胞与B细胞的接触，产生一定的体液免疫应答，但由于B细胞的分化成熟受到影响，无论是免疫强度还是效率都明显削弱，也很难维持长效的体液免疫作用。因此， 没有生发中心，就没有对抗原的长期免疫记忆”，这就是其它冠状病毒可能反复感染人体的原因，而我们注射的新冠疫苗一般不会引发细胞因子风暴，疫苗是具有保护效果的。 F 图1：COVID-19患者脾脏Bcl-6+生发中心B细胞数量明显减少。在同一组COVID-19患者的脾脏分析显示，有大量的红髓和少量的白髓；B细胞和T细胞显著减少； Bcl-6+生发中心B细胞明显减少。 图3：COVID-19淋巴结中泡泡和滤泡外T细胞B细胞接触和IgD-CD27-B细胞。利用StrataQuest软件量化细胞间的接触范围，以DAPI染色的细胞核为基础自动建立胞质边界，利用该算法准确识别组织中各个细胞。CD3+T细胞(红色)和CD19+B细胞(绿色)。 题目： Spatial distribution and functional analysis define the action pathway of Tim-3/Tim-3ligands in tumor development单位：山东大学基础医学院马春红教授团队 肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，不仅包含多种细胞类型，如肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞等，还包括附近区域内的细胞间质、微血管以及浸润在其中的生物分子。旨在增强免疫激活的免疫疗法，尤其是免疫检查点抑制剂虽然表现出引人注目的临床疗效，但大多数患者表现为新生或适应性耐药，整体疗效仍不令人满意。近来多项研究表明免疫细胞间及免疫细胞与其他细胞间的空间互作在很大程度上决定了抗肿瘤免疫应答强度，与肿瘤进展和临床预后密切相关。 2021年11月8日，山东大学基础医学院马春红教授团队在Molecular Therapy (IF=11.454)上发表文章。该研究从全新的空间角度描绘了Tim-3/Tim-3L介导的肿瘤免疫微环境互作网络，揭示了CD4+T细胞在其调控肿瘤进程中的关键性作用，为优化靶向Tim-3的肿瘤免疫治疗策略提供了新思路。本研究利用多色免疫荧光染色分析了TME中Tim-3/Tim-3L的空间分布特征，发现Tim-3高表达于多种肿瘤浸润淋巴细胞，且肿瘤实质区中Tim-3+CD4+细胞的比例与患者生存率显著负相关； Tim-3L在肿瘤组织中的表达显著升高，与Tim-3水平显著正相关，且Tim-3L+细胞临近的CD4+T细胞表达更高水平的Tim-3。动物实验和临床标本检测进一步证实， CD4T细胞在Tim-3抗体介导的抗肿瘤效应中发挥关键作用，并参与Tim-3阻断对肿瘤相关CD8+T和NK细胞功能的促进作用。 文中采用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统对肝细胞癌(HCC)组织芯片样本(TMA)进行多色荧光图像采集，并且通过StrataQuest定量分析软件对肿瘤组织和癌旁组织中不同类型的细胞数量比例，阳性率以及空间位置分布进行精准定量，同时，采用Al Clissifier功能对组织中的肿瘤区域和间质区域进行自动划分。在空间表型分析上，利用专利算法定义每个区域图像的细胞微环境，设立小于1个像素的阈值定义为细胞与细胞相互相邻或接触，将统一的算法和每个通道的阈值应用于TMA的所有样本，对各标记物的表达和荧光水平进行标准化分析。 Paracancerous tissues HCC tissues 关于TissueGnostics TissueGnostics公司致力于开发组织原位单细胞影像定量分析整体解决方案，研发能够服务于科研人员、辅助临床进行疑难杂症诊断、组织原位药物靶点筛选的工具。TG公司始终紧贴实际需求，自成立之初就和欧洲各大科研院所、企业建立广泛且深入的合作，不断解决一线科研人员的问题，在组织图像量化技术上积累了丰富的经验。TissueFAXS Cytometry技术在业界为用户提供了从影像到分析的多方面解决方案，解决了图像数据，特别组织图像难以准确定量和可信度低的痛点。智能化的工作流程使科学研究更加有效、准确。 TissueGnostics Asia Pacific Limited (TG-AP)地址：北京市丰台科技园汽车博物馆东路6号盈坤世纪 G-506电话：400-898-1980网址：www.tissuegnostics.com/cn 00 邮箱： office@tissuegnostics.cn