LCMS测定反义寡核苷酸分子量

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本文使用生物惰性超高效液相色谱四极杆质谱联用仪LCMS-2050测定反义寡核苷酸分子量。采用DUIS（ESI+APCI）负离子模式对待测样品进行质谱扫描，使用LabSolutions软件的“质谱多电荷分析”功能对质谱图进行解卷积分析。结果显示，质谱图中含5种多电荷离子，电荷数量为4~8。通过解卷积分析确认了该反义寡核苷酸样品分子量为6681.57 Da，与理论分子量的偏差为0.4 Da，质量准确度高。LCMS-2050具有质量范围宽的特点，适合分子量较大的反义寡核苷酸分子量检测。SSL-CA22-559Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-033 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS 测定反义寡核苷酸分子量 LCMS-033 摘要：本文使用生物惰性超高效液相色谱四极杆质谱联用仪LCMS-2050 测定反义寡核苷酸分子量。采用DUIS (ESI+APCI)负离子模式对待测样品进行质谱扫描，使用 LabSolutions 软件对质谱图进行多电荷分析。结果表明，质谱图中含5种多电荷离子，电荷数量为4~8。通过多电荷解卷积分析计算得到该反义寡核苷酸样品分子量为 6681.57 Da， 与理论值的偏差为0.4 Da，质量准确度高。LCMS-2050 具有质量范围宽的特点，适合分子量较大的反义寡核苷酸分子量检测。 关键词：单四极杆质谱 反义寡核苷酸分子量 质谱多电荷分析 技术特点： 水使用岛津最新单四极杆质谱仪，其采用 ESI/APCI(DUIS)加热型离子源，灵敏度高。 小反义寡核苷酸在 LCMS-2050 上形成数个多电荷，通过 LabSolutions 软件中“质谱多电荷分析”功能可准确测定其分子量。 小核酸药物是长度较短、碱基少于30nt的一类核酸药物，其通过作用于致病靶基因或者靶 mRNA，从根源上调控致病基因的表达，达到疾病治疗的目的。小核酸药物主要有反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide， ASO)、小干扰 RNA(small interferenceRNA， siRNA)、微小 RNA(micro RNA，miRNA)、RNA 适配体(RNA aptamer)、抗体核酸偶联药物 (antibody-siRNA conjugate ARC) 等。 其中， ASO 药物实质上是单链DNA， 或者 DNA与RNA杂合链，分子量的测定是其质量控制中非常重要的步骤之一。本文采用 LCMS-2050 采集得到 ASO 质谱图，并结合岛津 LabSolutions 软件的“质谱多电荷分析”功能对质谱图进行解卷积分析，可以准确测定 ASO 分子量。 LCMS-2050 具有质量范围宽的特点，适合分子量较大的 ASO 分子量测定。 生物惰性液相色谱仪 Nexera XS Inert 与单四极杆质谱仪 LCMS-2050 联用系统，具体配置信息如下： 系统控制器：CBM-40自动进样器：SIL-40C XSi脱气机：DGU-405柱温箱旬：：CTO-40C 输液泵：LC-40D XSi×2质谱仪：LCMS-2050单四极杆质谱仪 色谱工作站： LabSolutions Ver.5.114 图1高效液相色谱质谱联用仪 LCMS-2050 1.2分析条件 色谱柱 Shim-Pack Scepter C18-120 [Metal free] (50 mm×2.1mml.D.，3 um))，岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：227-31073-01) 进样体积： A 相-10 mM DIPEA+100 mM HFIP，进样体积： 5uL B相-乙腈 流 速： 0.3 mL/min 柱 温： 55℃ 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 5 6.00 Pumps Pump B Conc. 30 6.10 Pumps Pump B Conc. 95 7 Pumps Pump B Conc. 95 7.1 Pumps Pump B Conc. 5 12.00 Control Stop 质谱条件 离子雾化干燥加热 源DUIS (ESI+APCI) 脱溶剂温度： 450°℃气气气DL温度250°℃ 2.0 L/min 接接口电压： 一2kV ： 5.0 L/min ： 7.0 L/min 扫描3模式： Scan(一) 扫描范围：：50~2000 1.3样品前处理方法 将反义寡核苷酸样品用水溶解，并稀释至 50 ug/mL。 结果与讨论 2.1反义寡核苷酸样品色谱图与质谱图 该反义寡核苷酸为单链 DNA， 其总离子流图如图2所示，质谱图如图3所示。从质谱图得知，样品中不同电荷数的离子质谱信号明显。 图2 反义寡核苷酸总离子流图 图3 反义寡核苷酸质谱图 2.2质谱多电荷分析结果 通过岛津 LabSolutionsM软件的解卷积“质谱多电荷分析”功能对样品质谱图进行分析，首先在方法视图编辑多电荷分析参数，然后在定性处理中点击质谱多电荷分析，即可得到分析结果，具体操作步骤如图4所示。多电荷分析结果如图5所示，从结果得知，该反义寡核苷酸质谱图含5个不同电荷数离子峰，电荷数量为4~8，软件解卷积计算得到分子量为6681.57 Da， 各多电荷峰的质量数标准偏差为 0.436 Da。 该反义寡核苷酸样品序列为 G*C*G*T*T*T*G*C*T*C*T*T*C*T*T*C*T*T*G*C*G， 理论分子量为6681.57Da， 计算分子量与理论分子量偏差为 0.4 Da，计算结果准确度高。 图4 岛津 LabSolutionsM 的解卷积功能设置 图5 反义寡核苷酸分子量解卷积结果 表2理论分子量与实测分子量比较 样品名 序列 理论分子量(Da) 实测分子量(Da) 偏差 (Da) 反义寡核苷酸 G*C*G*T*T*T*G*C*T*C*T*T*C*T*T*C*T*T*G*C*G 6681.17 6681.57 0.4 结论 本文使用生物惰性超高效液相色谱四极杆质谱联用仪 LCMS-2050测定反义寡核苷酸分子量。采用DUIS(ESI+APCI)负离子模式对待测样品进行质谱扫描，使用 LabSolutions 软件的“质谱多电荷分析”功能对质谱图进行解卷积分析。结果显示，质谱图中含5种多电荷离子，电荷数量为4~8。通过解卷积分析确认了该反义寡核苷酸样品分子量为6681.57 Da， 与理论分子量的偏差为0.4 Da，质量准确度高。LCMS-2050具有质量范围宽的特点，适合分子量较大的反义寡核苷酸分子量检测。 岛津应用云