LCMS测定小干扰核苷酸siRNA分子量

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本文使用生物惰性超高效液相色谱仪Nexera XS inert与LCMS-2050连用，测定了小干扰核苷酸siRNA分子量。通过方法优化，去除了质谱图中干扰离子峰，结合LabSolutions软件质谱多电荷分析功能准确测得了siRNA分子量。岛津SHIMADZUSSL-CA22-565Excellence in Science 岛津SHIMADZUExcellence in ScienceLCMS-035 LCMS-035 摘要：本文使用生物惰性超高效液相色谱仪 Nexera XS inert 与 LCMS-2050 连用，测定了小干扰核苷酸siRNA 分子量。采用 DUIS (ESI+APCI) 离子源的负离子模式分析待测样品，通过优化流动相和质谱采集参数，去除干扰质谱峰， 使用 LabSolutions 软件自带的“质谱多电荷分析”功能准确测定 siRNA 分子量。结果显示，siRNA 正义链质谱图中含8种多电荷离子，电荷数量分布为4~11，多电荷分析测定分子量为 6631.63 Da， 与理论值的偏差为0.34 Da。 siRNA 反义链质谱图中含7种多电荷离子，电荷数量为4~10，多电荷分析测定分子量为 6637.64 Da， 与理论值的偏差为0.39 Da， 质量准确度高。LCMS-2050 具有质量范围宽的特点，结合LabSolutions 软件自带的“质谱多电荷分析”功能，可以用于测定 siRNA 分子量。 关键词：单四极杆质谱 siRNA 分子量质谱多电荷分析 技术特点： 必在流动相中添加微量 EDTA， 络合系统中Na+， 排除了加钠峰对分子量的干扰。 小核酸药物是长度较短、碱基少于 30 nt 的一类核酸药物，其通过作用于致病靶基因或者靶 mRNA，从根源上调控致病基因的表达，达到疾病治疗的目的。小核酸药物主要有反义寡核苷酸 (antisenseoligonucleotide，ASO) 、小干扰 RNA (smallinterferenceRNA， siRNA)、、微小 RNA (micro RNA， miRNA)、RNA适配体 (RNA aptamer)、抗体核酸偶联药物(antibody-siRNA conjugate ARC) 等。 其中， siRNA 为双链 RNA， 分子量的测定是其质量控制中非常重要的步骤之一。本文采用 LCMS-2050采集得到 siRNA 质谱图，并结合岛津 LabSolutions软件的“质谱多电荷分析”功能对质谱图进行解卷积分析，，可以准确测定 siRNA分子量。LCMS-2050 具有质量范围宽的特点，适合分子量较大的 siRNA 分子量测定。 实验部分 1.1仪器 生物惰性超高效液相色谱四极杆质谱联用仪LCMS-2050， 具体配置信息如下： 系统控制器：(CBM-40脱 气 机：：DGU-405输液泵：LC-40D XSi×2自动进样器：SIL-40C XSi柱温箱：CTO-40C质 谱 仪：：LCMS-2050 单四极杆质谱仪 色谱工作站：：LabSolutions Ver. 5.114 图1高效液相色谱质谱联用仪 LCMS-2050 1.2分析条件 色谱柱：Shim-Pack Scepter C18-120[Metal free] (50 mm×2.1 mml.D.， 3um))，，岛津(上海)实验器材有限公司，， P/N： 227-31073-01) 流云动相： A 相-10 mM DIPEA+25 mM HFIP + 10 uM EDTA，B相-乙腈 进样体积：10 pL 流 速：：0.3mL/min 柱 温：55℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 Time (min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 5 2.00 Pumps Pump B Conc. 6 10.00 Pumps Pump B Conc. 8 10.10 Pumps Pump B Conc. 95 12.00 Pumps Pump B Conc. 95 12.10 Pumps Pump B Conc. 5 16 Control Stop 质谱条件 1.3样品前处理方法 将 siRNA 样品用水溶解，并稀释至50 ug/mL。 结果与讨论 2.1方法优化 该 siRNA 样品为双链RNA， 分别为正义链和反义链。在色谱条件下分离为两个峰，其总离子流图如图2所示，质谱图如图3所示。从质谱图可以看出，质谱峰非常杂乱，这对 siRNA 分子量的确定造成了严重的干扰，所以需优化方法，去除干扰质谱峰。 图2siRNA 总离子流图 图3 siRNA质谱图(左图：正义链；右图：反义链) 以下以正义链为例，描述方法优化过程。通过岛津 LabSolutionsM软件“质谱多电荷分析”功能对质谱图进行解卷积分析，分析结果如图4所示。质谱图解卷积后得到4个分子量，分别为6799.1、6631.1、6652.8、6821.2Da，其比例分别为100：96： 46： 35。其中6631.1为 siRNA 正义链分子量，6799.1与6631.1相差168.0，推测其为正义链加和流动相中六氟异丙醇(HFIP，分子量为169)加和后得到的分子量。6652.8与6631.1相差21.7，推测其为正义链加和系统中钠离子。6821.2与6631.1相差190.1，推测为正义链加和 HFIP和 Na 后得到的分子量。 6550 6600 6650 6700 mass 6700 6750 6800 6850 mass 图4 siRNA 分子量解卷积结果 为了去除质谱图中的加和离子，首先在流动相中添加 10 uM EDTA， 用于络合系统中Na， 去除 M+Na 峰。多电荷解卷积结果如图5所示，结果显示 siRNA 已无明显加钠峰。 图5流动相加入 EDTA 后 siRNA 分子量解卷积结果 为了去除 HFIP 加和峰，本实验对Qarray 电压进行调整。将 Qarray 电压分别设置为-20、-50、-80V， 得到的质谱图如图6所示。从图可知， 当Qarray 电压为-20V时，质谱图中还是有678.81、754.31等正义链加和 HFIP 后的多电荷峰。当 Qarray 电压为-50V时，去除了正义链加和 HFIP的多电荷峰，质谱图变得非常干净。当进一步加大 Qarray 电压至-80V时，带电荷较多的质谱峰响应明显下降，且产生了新的碎裂。所以最终确定Qarray 电压为-50V。 图6 不同 Qarray 电压得到的 siRNA 质谱图(上：-20V，中：-50V， 下：-80V) 2.2质谱多电荷分析结果 对优化后得到的质谱图进行多电荷解卷积分析，分析结果如图7所示。从结果得知，该 siRNA 正义链质谱图含8个不同电荷数离子峰，电荷数量为4~11，软件解卷积计算得到分子量为 6631.63 Da， 各多电荷峰的质量数标准偏差为 0.422 Da。 siRNA 反义链质谱图含7个不同电荷数离子峰，电荷数量为4~10，软件解卷积计算得到分子量为 6637.64 Da， 各多电荷峰的质量数标准偏差为 0.569 Da。 物质 加合离子 检测 名称 质量 类型 质量 电荷 峰数 标准偏差 报告 积分强度 强度比 确定 Auto6631.6381 6631.6381(H+) -1.00728 -1 88 0.422 回 744528 100.00 取消 帮助 参数... 打印... 登录 Inton.(x100.000) Base Peak： 662.16/274，018 662.16 ■多电荷显示标记 2.5 735.86[M-9HJ 2.0- [M-10H]10- 1.5- [M-8H] 1.0 M827.96-7HJ M-6H [M-5H一 [M-4H4 0.5- [M-11H]-601，86 946.36 1104.16 1325.16 1656.76 0.0- 250 500 750 1000 1250 1500 1750 m/Z 有效 检测 m/z 电荷 实际电荷 质量 加权 强度 Inten.(x10.000) Base Peak： 6.631.64/ 92.423 6631.64 1 回 Auto 1656.7600 44.0003 6631.06912 0.032 23920 2 回 Auto 1325.1600 55.0006 6630.83640 0.027 20121 7.5- 3 回 Auto 1104.1600 66.0005 6631.00368 0.043 32032 4 回 Auto 946.3600 77.0000 6631.57096 0.062 45865 5 Auto 827.9600 87.9998 6631.73824 0.094 70037 5.0- 6 回 Auto 735.8600 98.9997 6631.80552 0.323 240392 7 回 Auto 662.1600 109.9999 6631.67280 0.368 274018 2.5一 8 Auto 601.8600 1111.000 6631.54008 0.051 38143 0.1 6550.06575.06600.0 6625.06650.06675.0 6700.0 m8SS Ql④l 图7 siRNA 正义链与反义链分子量解卷积结果 该 siRNA 正义链和反义链序列如表2所示，理论分子量分别为 6631.97 和6638.03 Da， 实测分子量与理论分子量的偏差分别为0.34和0.39 Da。 表2理论分子量与实测分子量比较 样品名 序列 理论分子量(Da) 实测分子量(Da) 偏差 (Da) siRNA 正义链 AUGGAAUACUCUUGGUUACdTdT 6631.97 6631.63 0.34 siRNA 反义链 GUAACCAAGAGUAUUCCAUdTdT 6638.03 6637.64 0.39 结论 本文使用生物惰性超高效液相色谱仪 Nexera XS inert 与 LCMS-2050 连用，测定了小干扰核苷酸 siRNA 分子量。通过方法优化，去除了质谱图中干扰离子峰，结合LabSolutions 软件质谱多电荷分析功能准确测得了siRNA 分子量。 岛津应用云