血液和尿液中安眠镇静类药物的测定

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液体检材经过离心后，加入缓冲液进行稀释，用HLB固相萃取柱经睿科Fotector Plus全自动固相萃取仪净化，二氯甲烷洗脱，洗脱液经睿科AutoEVA 80全自动氮吹浓缩仪浓缩后，供GC/MS上机检测。实验结果显示九种化合物的回收率在73%~109%之间，RSD<10%，说明本方法能够用于血液和尿液中九种安眠镇静类药物的测定。关键字：全自动固相萃取；气相色谱-质谱联用法；安眠镇静类药物自动化样品前处理解决方案-RK-2022-FP003 解决方案 血液和尿液中安眠镇静类药物的测定 关键词 全自动固相萃取； 气相色谱-质谱联用法；安眠镇静类药物 介绍 液体检材经过离心后，加入缓冲液进行稀释，用HLB固相萃取柱经睿科Fotector Plus全自动固相萃取仪净化，二氯甲烷洗脱，洗脱液经睿科AutoEVA 80全自动氮吹 浓缩仪浓缩后，供GC/MS上机检测。实验结果显示九种化合物的回收率在73%~109%之 间， RSD<10%， 说明本方法能够用于血液和尿液中九种安眠镇静类药物的测定。 1.仪器、试剂以及耗材 1.1仪器和设备 Raykol Fotector Plus睿科全自动固相萃取仪 Raykol Auto EVA 80睿科全自动氮吹浓缩仪 Agilent 7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪 色谱柱Agient HP-5MS（50m×250μm×0.25μm） HLB固相萃取柱（RayCure，60mg/3mL，货号：RC-204-36473） 1.2试剂和标准品 二氯甲烷，甲醇，超纯水，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠 磷酸盐缓冲液（pH=6.0） 2.样品提取与前处理 2.1样品前处理 取2mL液体检材，加入8mL磷酸盐缓冲液（pH=6.0），5000 r/min离心5min，取上 清液到玻璃试管中，待净化。 如果已经腐败的血液，需先进行10000 r/min高速离心5min，然后取上清液加入磷酸盐 缓冲液，待净化。如果是已加入抗凝剂的血液，则可以根据情况加入2-8mL磷酸盐缓冲液，离心后待净化。 2.2固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus 固相萃取柱 HLB(RayCure，60mg/3mL) 淋洗 磷酸盐缓冲液（pH=6.0） 洗脱 二氯甲烷 表-1固相萃取净化条件 2.3样品净化步骤 依次用5mL二氯甲烷，5mL甲醇和5mL磷酸盐缓冲液（pH=6.0）对固相萃取柱进行 活化，活化速度为2mL/min。以2mL/min的速度上样10mL待测液，3mL磷酸缓冲溶液 （pH=6.0）润洗样品瓶并过柱，25psi氮气吹干小柱5min。最后以5mL二氯甲烷用1mL/min 的速度洗脱，洗脱液用睿科AutoEVA80全自动氮吹浓缩仪于40℃浓缩至0.5mL以下，用二 氯甲烷定容至0.5mL。详细步骤见图-1。 图-1. Fotector Plus液体检材中安眠镇静类药物固相萃取净化方法 3.检测条件 3.1气相色谱质谱联用条件 GC-MS检测条件：进样口温度290 ℃，不分流进样，进样量1.0L；载气为高纯He气，恒流模式，流速为1.0mL/min；电子轰击电离源（EI），离子源温度230 ℃，接口（传输线）温度280 ℃，质量分析器温度150 ℃，全扫描模式（Scan），电子倍增器检测电压1576V。 GC升温程序：初始温度50 ℃，保持1min；以20 ℃/min速度升温至150 ℃，保持2min；以10 ℃/min速度升温至300 ℃，保持5min。 3.2定量离子及保留时间 化合物 英文名称 CAS 保留时间 离子碎片 巴比妥 Barbital 57-44-3 10.218 156,141 异戊巴比妥 Amobarbital 57-43-2 12.993 156,141 速可眠 Secobarbital 309-43-3 13.856 168,167,97 苯巴比妥 Phenobarbital 1950/6/6 15.803 204,117,77 异丙嗪 Promethazine 60-87-7 18.886 72,284 安定 Diazapam 439-14-5 20.324 256,283 氯丙嗪 Chlorpromazine 50-53-3 20.75 318,58,86 三氟拉嗪 Trifluoperazine 117-89-5 22.091 113,248 氯氮平 Clozapine 5786-21-0 23.645 243,256,192 表-1九种安眠镇静类药物的保留时间及离子碎片 3.3标准样品色谱图 图-2九种安眠镇静类药物的TIC谱图(10 mg/L) 图-3实际血样加标固相萃取净化后的TIC谱图(10mg/L) 4.方法可行性验证 在2mg/L的加标水平下，样品经过前处理后，整体平均回收率在73%~109%之间，RSD （n=4）<10%，满足质控要求。详细结果如表-2所示。 化合物 血液 尿液 Avg.（%） RSD（%） Avg.（%） RSD（%） 巴比妥 89.5 2.9 75.3 5.4 异戊巴比妥 88.4 5.5 115 5.3 速可眠 84.0 5.1 112.3 5.2 苯巴比妥 76.4 6.9 108.5 6.7 异丙嗪 99.4 3.2 73.8 0.8 安定 94.3 2.8 102.6 1.9 氯丙嗪 84.1 3.4 99.4 1.3 三氟拉嗪 92.8 6.7 97.5 0.2 氯氮平 107.9 4.2 91.5 0.3 表-2加标回收率及RSD值(n=4) 5.结果与讨论 5.1在洗脱步骤前需要将固相萃取小柱尽量吹干，否则会影响洗脱效果及后续的氮吹。 5.2经过验证本方法同样适用于液体检材中毒品及农残类化合物的测定，经验证的毒品有 二乙酰吗啡、6-单乙酰吗啡、罂粟碱、蒂巴因、可待因、氯胺酮；农残类化合物有敌敌畏、甲拌磷、毒死蜱、对硫磷、甲基对硫磷、乐果、甲胺磷、氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰 戊菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯。 6.总结 本方案有效地解决血液和尿液中安眠镇静类药物的净化和浓缩过程，Fotector Plus全自 动固相萃取仪给实验室人员带来便利，高精度的注射泵和精准的控速让实验室人员告别了上 样体积、上样速度、洗脱速度不准确的困恼，多通道同时运行并能连续运行十排，提高前处 理效率。净化后的洗脱液可直接通过 AutoEVA-80全自动氮吹浓缩仪进行浓缩，只需 30min 便可浓缩 60个样品，彻底解决样品量多且时间耗费长的问题，两者并用起来，可使实验工 作效率大幅提升。