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本文建立了一种使用岛津在线自动前处理仪CLAM-2030和三重四极杆液质联用仪LCMS-8050测定血液中EtG的方法。此联用系统从吸取样品、沉淀剂,到样品混匀、过滤以及将处理完的样品输送到LCMS/MS自动进样器,全部仪器自动完成。不涉及手动前处理操作,减小了人为误差,提高分析的准确度。本实验中检出限小于0.05 μg/mL,基质校准曲线的线性范围为0.1~10 μg/mL,准确度在85.3%~106.3%之间,方法灵敏度和准确度高,适合血液中乙基葡萄糖醛酸苷的检测,可供公安司法领域检测人员参考。 SSL-CA23-104Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-761 CLAM-2030 与 LCMS-8050联用系统测定血 液中的乙基葡萄糖醛酸苷 LCMSMS-761 摘要:本文参考《GA/T 1633-2019法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气相色谱-质 谱和液相色 谱-质谱法》建立了一种使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2030 和 三 重四极杆液质联用仪 LCMS-8050 测定血 液中的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的检 测 方法。实验结果表明,该方法检出限 小 于0.05 ug/mL, 基质校准曲 线的线性范围为 0.1~10 ug/mL, 准确度在 85.3%~106.3%之间 。重复性保留时间和峰面积RSD%分别在0.07%~0.09%和1.99 %~2.65%之间。质控样品的平均 回 收率在101.3~117.4% 之间, RSD% 在1.77~4.31%之间 ,满足标准的相关要求,适合血液中乙基葡萄糖醛酸 苷 的液相色谱-质谱法检测。 关键词:乙基葡萄糖醛酸苷 CLAM-2030 血液 GA/T 1633-2019 技术特点 : 必自动前处理仪 CLAM-2030 与 LCMS/MS在线联用,无需手动操作,前处理简单方便。 乙基葡萄糖醛酸苷 (Ethyl Glucuronide, EtG) 是乙 醇在人体内代谢的标志性代谢物。相较 于 乙醇,其在血 液中存在 时 间更久,通常情况下, EtG 在血液中 的 存在 时间约为12h, 血液中 EtG 检测结果是判定个体在12h 内是否饮酒的重要证据。此外,血液中 EtG 的测 定 ,对 判定乙醇来源、区分是否血液腐败产生乙醇有 着 重要的 意义。 EtG 的 检测方法有 LC-MS/MS 和 GC-MS/MS 等,GC-MS/MS检测时,需要对 EtG 进行衍 生 ,前处理较为 复 杂,而用 LC-MS/MS 检测 EtG 则不需要衍生。 岛津开发 的 CLAM-2030 与 LC-MS/MS 联用系统,,可 对全血、血浆、血清、尿液、唾液等生物样品自动进行 蛋白沉淀操作,然后将上清液自动传输至 LC-MS/MS 进 行定量检测。本文使用该联用系统,参考《GA/T 1633-2019 法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气 相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》,建立了血液中 EtG 的 LC-MS/MS 分析方法。该方法前处理简单,灵敏 度 和 准确度高,适合血液中的 EtG 检测方法。 1.1仪器 本实验使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2030 和岛津质谱 LCMS -8050,具体配置如下: 系统控制器: CBM-20A 脱 气 机::DGU-20A5R 输液 泵 LC-30AD×2自动进样器::SIL-30AC 柱温 箱: CTO-20A 质 谱 仪::LCMS -8050前处理模块:CLAM-2030色谱工作站:LabSolutions Ver. 5.93 图11CLAM-2030+LCMS-8050 联用系统 1.2分析条件 液相色谱条件 色 谱 柱: Shim-pack Scepter C18-120 (100 mm x2.1 mml.D., 1.9 um,岛津 (上海)实验器材有限公司,P/N:227-31012-05) 流 动 相 A-0.01%甲酸-水溶液;B-甲醇溶液 :进样体积 luL 柱 温:40℃流 速 0.3 mL/min 洗针 液:甲醇/水=1:1 (v:v) 洗脱方式: 梯度洗脱,B相起始浓度为7%,时间程序如表1所示。 表 1 梯 度洗脱时 间 程序 时间 (min) 单元 处理命令 值 1.00 泵 B Conc 7 2.00 泵 B Conc 60 3.00 泵 B Conc 60 3.10 泵 B Conc 7 6.00 控制器 STOP 质谱条件 子化模式:ESI(-)加热模块温度:400°℃加热气流速:空气 10.0 L/min 接口温度:300℃雾化气流速:氮气3.0L/min DL 温 度:250°℃干燥气流速:氮气10.0L/min 接口 电压:-2kV 扫描模式:多反应监测(MRM)MRM 渗 参 数:见表2 表2 15种卡西 酮 类新精神活性物质和内标的 MRM 参数 序号 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE Q3 Pre Bias (V) 1 乙基葡萄糖醛酸苷 221.15 74.95* 17.0 22.0 27.0 85.00 13.0 27.0 24.0 *代表定 量 离子对。 1.3校准曲线溶液配制 取 EtG 对照品储备液(100 ug/mL),用乙腈逐级稀释,分别得到0.5, 1, 2, 5, 10, 50和 100 ug/mL 的 标准工作溶液。分别取各浓度的标准工作溶液100 uL, 加入900uL空白血液得到浓度分别为 0.05,0.1,0.2,0.5, 1,5和 10 ug/mL基质校准曲线溶液。 1.4样品前处理 在 CLAM-2030 工作站界面优化自动前处理参数、蛋白 沉 淀剂使用量、震摇转速、震摇时间、抽滤时间等 。确定样品自动前处理程序具体操作为: (1)吸取20uL甲醇活化过滤管,准备上样; (2)吸取基质校准曲线溶液或血液样品 50 uL 上样; (3)吸取水50 uL稀释样品; (3)吸取样本提取剂250uL; (4)转速 3000 rpm 震摇90s进行提取; (5)使用-50~-60 kPa 的负压抽滤过滤管60s; (6)接收管转移至自动进样器,进样1uL(详见图2)。 图2 CLAM-2030 在 线自动前处理过程 结果与讨论 2.1检出限和定量限溶液 MRM 色谱图 按1.2中的分析条件进行 测 定,0.05pg/mL 的检出限溶液色谱图的 S/N 大于3,0.1 ug/mL定量限溶液色谱 图的 S/N 大于10,灵敏度良好,符合定量要求。检出限和定量限溶液的 MRM色谱图如下图3所示。 图 3 EtG 检出限和定量限溶液 MRM 色谱G (0.1ug/mL) 2.2校准曲线 按1.2中的分析条件进行测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,外标法绘制校准曲线,所得校准曲线线 性范围为 0.1~10 ug/mL, 线性关系良好,相关系数大于0.999, 准确度在 85.3%~106.3%之 间,校准曲线如 下 图4所示。 图4 EtG 校准 曲线 2.3精密度实验 按1.2中的分析条件进行测 定 ,选择低中高三个浓度对照品溶液,分别连续进样测定4次,考 察 仪器的精密 度 ,保留时间和 峰 面积的相对标准偏差如表3所示, RSD%分别在0.07%~0.09%和1.99%~2.65%之间,实验 结果表明,该分析方法具有良好的精密度。 表3 保留时间和峰 面 积精密度结果 (n=4) 序号 浓度(ug/mL) 保留时间 (RSD%) 峰面积 (RSD%) 1 0.1 0.09 2.65 2 1 0.07 2.16 3 10 0.07 1.99 2.4回 收率 向 空 白血液中添加 EtG标准品溶液,配制成浓度为0.1,1和10 ug/mL的样品加标溶液,每个水 平 重复测定 3次,加标样品的准确度和精密度结果如表4所示,平均回收率在 101.3~117.4% 之间, RSD% 在 1.77~4.31%之间。 表47方法回 收 率结果(n =3) 序号 加标浓度度 (ug/mL) 回收率 (RSD%) 相对标准偏差 (RSD%) 1 0.1 105.0 4.31 2 1 117.4 1.43 3 10 101.3 1.77 ■结论 本文建立了 一 种使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2030 和三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050 测 定 血液中EtG 的方法 。此联用系统从吸取样品、沉淀剂,到样品混匀、过滤以及将处理完的样品输送到 LCMS/MS 自动进样器,全部仪器自动完成。不涉及手动前处理操作,减小了人为误差,提高分析的准确 度 。本实验中检出限小 于 0.05 ug/mL,基质校准 曲 线的线性范围为 0.1~10 ug/mL, 准确度在 85.3%~106.3%之间,方法灵敏度和准确度高,适合血 液中乙基葡萄糖醛酸苷的检测,可供公安司法领域检测人员参考。 岛津应用云
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岛津企业管理(中国)有限公司为您提供《CLAM-2030与LCMS-8050联用系统测定血液中的乙基葡萄糖醛酸苷》,该方案主要用于全血/血清/血浆中生化检验检测,参考标准《暂无》,《CLAM-2030与LCMS-8050联用系统测定血液中的乙基葡萄糖醛酸苷》用到的仪器有岛津三重四极杆液质谱联用仪LCMS-8050。
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