使用AEI源-TSQ 9610三重四极杆气质联用仪测定 尿液中有机酸

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本文采用TSQ 9610 AEI源对尿液中10种有机酸测定进行了方法 学验证，实验结果证明方法线性与重复性良好，灵敏度高，可很 好地满足尿液中有机酸分析的需求。ThermoFisherSCIENTIFICAN_GCMS_23007 表1气相与质谱参数 使用AEI源-TSQ 9610三重四极杆气质联用仪测定 尿液中有机酸 王 仁萍 赛默 飞 世 尔科技 (中 国)有限 公司 关键词： TSQ 9610三重四极杆气质联用仪， AEI， T-SRM， 尿液，有机酸，衍生化 摘要 建 立 了 T SQ 9610三重四极杆气质联 用 仪 测 定 尿液中有机酸的 方法。实验结 果 表明，10种 有 机酸在50~1000 n g/m L 浓度范 围 内标准 曲 线线性良好 ，判定系数均在0.998以上，20 ng /m l 标准溶液连续进 样6次，峰面积RSD值均 小 于 4.0%，重 复性良 好，同 时方法具有较好的灵敏度，可用于尿液中有机酸的定量 分析。 引言 尿液中有机 酸 包括 单 羧酸、二羧酸、三羧酸、羟基酸、酚酸以 及 其他含氮酸，通常作为细胞内各 种 代 谢途径 的 中间体，是遗 传代谢病的典型生物标志物。有机酸尿症是 儿 童遗传代谢性疾 病中较常 见 的病种，该类疾病发病率较高，如 不 能准确诊断、合理治疗，死亡率非 常 高 。此外 也有 研究表明，二型糖尿病、肝癌、哮喘、慢性 阻 塞性肺病、炎症性肠病等患者尿液中的有 机 酸 水 平 同 样 存 在 异常可以作为 生 物标志物辅 助 疾病发 病 机 制 研究，因此尿液中有机酸分析至 关 重要。 目前应 用 GC -MS 分 析尿液中 有 机酸是 有 机酸尿症筛查与诊断的 可靠方法 ，i 已作为常规筛查手段应用于新生 儿 筛查。GC -M S 技 术长于筛查或者非靶 向 的分析，但囿于有 限 的定量功能而短于 靶 标 分析。GC-M S /M S可以 弥 补G C -M S 的技 术 局限性，能 够集 全 扫描相 对 定量 与S RM 、SIM(多反应监测、选择离子扫描)靶 标 绝对定量于一体，可 以更好地满足 有机 酸筛查 与 准确定量 的研究需求，进一步提高方法选择 性 和 准确性 ，排除假阴 性 与 假阳性的结果。 本文基于赛默 飞T SQ 9610三重四极杆气质 联 用 平 台 建立了分 析 尿液中 10种有机酸的 方 法。样品前处理采 用了 代谢组学常 用 的方法，其 原理是 取 尿液样品加一 定 量的脲酶去除尿素，然后 有 机溶剂 进 行液液萃 取 ，最后通过M S T F A+1%TMCS衍生化试 剂衍生， GC -MS/M S 测 定有机酸的衍生产物。该方法具有较好 的灵敏度，重 复性和线性，可用于人体尿液中有机酸的准确定 量，辅助有机 酸 尿症的诊断，此外可以为其他有 机 酸的定量提 供参考。 1.实验部分 1.1仪器 与 色 谱 条 件 T he r mo Scient i f i c TM A S 1610 液体自动进样器 T he r m o Sci e nt i f i cTM T R ACE 1610气相 色 谱仪 T hermo Scient i f i c TM T SQ 9610 三重四 极 杆气 质 联 用 仪 配 备A E I 源 TRACE 1610 GC气相参数 色谱柱 TG-5SILMS 30 m*0.25 mm*0.25Lum 进样口 P/N： 26096-1420 分流不分流进样口(SSL) 衬管 超惰性分流衬管 PN：453A1255-UI 进样模式 分流进样 分流比 5：1 隔垫吹扫流量 5 ml/min 进样口温度 280°C 载气，流速 高纯氦气(99.999%)， 1 ml/min 进样体积 1.0uL 程序升温 100 ℃(保持5.0 min)， 5℃/min升温至 120℃(保持5.0 min)， 15℃/min升温至140℃，5℃/min升温至 180℃(保持5 min)， 20℃/min升温至280℃ (保持5 min) TSQ 9610 质谱参数 传输线温度(℃) 280°℃ 离子源温度(℃) 300°℃ 数据采集模式 Timed-SRM 采集离子对 各化合物的采集离子对信息见表2 表2有机酸TMS衍生物Timed-SRM参数 化合物名称 有机酸CAS 保留时间(min) 定量离子对(eV) 定性离子对(eV) 苯甲酸1 65-85-0 8.00 179.10/105.10(14) 179.10/135.10(8) 琥珀酸2 110-15-6 9.97 147.10/73.10(14) 147.10/45.10(30) 苹果酸3 6915-15-7 16.74 147.10/73.10(14) 233.10/73.10(10) 己二酸² 124-04-9 17.21 111.10/83.10(6) 111.10/55.10(10) 草酰乙酸4 328-42-7 17.7 147.10/73.10(15) 73.10/45.10(10) 2-酮戊二酸4 328-50-7 20.35 260.20/73.10(22) 170.10/73.10(12) 对羟基苯乙酸² 156-38-7 20.55 179.10/73.10(12) 73.10/45.10(12) 高香草酸2 306-08-1 23.54 209.10/73.10(12) 311.20/296.20(6) 柠檬酸5 77-92-9 24.72 273.10/183.10(8) 273.10/73.10(18) 异柠檬酸5 320-77-4 24.84 245.20/73.10(14) 147.10/73.10(14) 1：1TMS衍生物 2： 2TMS衍生物 3：3TMS衍生物 4： MeOX-TMS衍生物 5： 4TMS衍生物 1.2标准 品 溶 液 配制 为了减少基 质 效应的影响，通过 人工 合成尿液样 品 进 行 标 准 曲线溶液的 配 制 。标 准 曲线浓度分 别 为：50，100，200，500，1000ng/ml。 1.3仪 器参 数 和 方 法优化 参考文献报道方法"进 行 有机 酸 的前 处 理衍 生 方 法，取50pl的尿液加10 pl 脲 酶(0.01 g /ml )， 涡 旋，40℃孵化60 min，样品 冷 却 至室温，加入130 u l甲醇，涡旋，4℃离心 10 m in ， 取 160pl 上 清液室温下真空 干 燥，干 燥 后 残渣加入50 pl 2% MeO X (无 水 吡啶溶 剂)70℃孵化 2 h 以 此 保护酮基，样品冷却至室温 后 ，加入100 p l M STF A 1% T M CS， 涡旋， 70℃ 孵化 1h使有机酸生成 T M S 衍生 物。 2.实验结果 2.1色 谱图 基 于 以 上 色 谱条件，采 用T SQ9610系统分析，10种有 机酸的定量离 子 色 谱图如图 1。 图1标准溶液定 量 色谱图 (100ng/ml ) 2.2灵 敏 度与重 复 性 测 试 灵敏度测试采用 10 ng/ml 进样分 析 ，谱图见图2，按照 p e a k to pea k 计 算信噪比，结 果 见 表3。浓度20 ng/ml连续进样六次 的 峰 面积重 复性均 小于 4%，结 果 同见表3。 图2标准溶液定量色谱图(10ng/ml) 表3方法学结果 化合物名称 保留时间(min) 判定系数R² 10 ng/ml 信噪比 20 ng/ml重复性(%) 苯甲酸1 8.00 0.9998 302.1 1.48 琥珀酸2 9.97 0.9980 154.7 2.14 苹果酸3 16.74 0.9997 16.0 1.30 己二酸² 17.21 0.9997 284.9 3.79 草酰乙酸4 17.7 0.9998 12.1 0.88 2-酮戊二酸4 20.35 0.9987 78.7 2.17 对羟基苯乙酸² 20.55 0.9998 512.8 3.68 高香草酸2 23.54 0.9998 122.5 1.76 柠檬酸5 24.72 0.9998 143.5 3.18 异柠檬酸5 24.86 0.9998 46.4 2.69 2.3线性 50-1000 ng /ml 浓度 范 围 内 各化合物的判定系数 均大于 0.9980(见 表3)，线性关系良好，标准曲线见图 3。 图310种有机酸标准曲线 (50-1000 ng/ml) 本文采用 T S Q 9610 A EI源 对 尿液中 10种有机酸测定进行了方法 学验 证 ，实验结 果 证明方法线性与重复性良好 ，灵敏度高，可很 好 地 满足尿液中 有 机酸分析的需求。 [1].T .Mous k eftara， C. Virg ili ou， G . T heodo r idis， H . Gika， A na l ysis o f u rina r y organi c acid s by gas chr omatogra ph y ta n d e m m ass s pe c trometry metho d f or me t abol i c p r o fi lin g app l i c at io n s ， J . Chro -m atog r . A 1658 (2021) 462590