【系列一】IPHASE/汇智和源 体外药代动力学研究热点问题解答

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体外药代动力学研究—热点问题—第一题    在代谢稳定性研究中，肝微粒体&肝细胞？该如何选择？在代谢稳定性研究中，选肝微粒体还是选肝细胞，主要还是要看化合物的代谢特性，谁代谢速率高选谁。一般情况下，优先选用肝微粒体，尤其是在化合物分子水溶性较强、一相代谢为主要代谢途径（尤其是经由CYP）等情况下，肝微粒体为最优选择。当有证据显示二相代谢为主要途径、水解作用为主要代谢途径、肝微粒体中非特异性蛋白结合很高、肝微粒体中代谢不明显的时候，可使用肝细胞进行实验。第二题    代谢稳定性实验中微粒体浓度是考察过的吗?过高或过低有什么影响呢？在代谢稳定性实验中，通常选择的微粒体蛋白浓度为0.1mg/mL~1mg/mL，具体选用多大蛋白浓度需根据化合物自身代谢特性去选择。微粒体蛋白浓度过高，会导致药物和微粒体蛋白非特异性的结合；而微粒体浓度过低，则可能导致药物的代谢不明显。第三题    非特异性蛋白结合对实验结果有什么影响？药物分子在孵育体系中是可以与微粒体蛋白结合的。蛋白浓度越高，游离分数的fu值越小，就会造成实测Clint值与理论上的“真值”差异越大（实测值比理论值小）。必要时，可以通过测定孵育体系中的fu值进行校正。第四题    药物只做一相代谢可代谢10%，只做二相代谢也只代谢10%，但使用二相代谢试剂盒却可代谢50%，如何解释？药物的生物转化，分为一相代谢反应和二相代谢反应。药物在一相代谢反应中主要发生氧化、还原和水解的反应，经过一相代谢反应，药物可能带有一些极性基团，如羟基、羧基等。二相代谢，又称结合反应，一相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子发生结合，使药物毒性、活性降低或极性增加而易于排出的反应。一般来说，药物先进行一相反应进行转化，如果极性依然较弱，则会启动二相反应，但有些药物可直接进行二相反应。所以，才会有以上现象的存在。第五题    半衰期和清除率怎么计算？将受试物在0min浓度作为100%，各时间点的受试物浓度与0min浓度相比得到剩余百分数。各时间点的受试物剩余百分数的自然对数与孵育时间经线性回归，求得斜率(k)，由公式求得各种属微粒体中的消除半衰期t1/2和体外肝微粒体中的固有清除率Clint in vitro。第六题    原代肝细胞代谢稳定性实验细胞密度推荐多少？清除率计算和肝微粒体一样的吗？原代肝细胞代谢稳定性实验推荐的细胞密度为0.5~2×10^6个/mL，清除率计算和肝微粒体代谢稳定性实验的结果处理方法是一致的。第七题    代谢稳定性研究试剂盒中阳性底物的作用是什么？孵育时间点应如何设置？试剂盒中阳性底物的作用主要是为了证实试剂盒的有效性。孵育时间点的设置主要看是基于什么实验目的，若只是为了验证孵育系统是否正常工作，仅需设置0点和一个非零时间点即可；若需考察阳性底物的代谢稳定性特征，则需设置0点和3~5个非0时间点。第八题    肝微粒体实验中，孵育时是否要开盖保证有氧气的参与？理论上来讲，一相代谢反应是有氧反应，需要有氧气的供应，我们内部曾做过验证，液面上层有足够空气，孵育时开不开盖对结果没有影响。第九题    代谢稳定性实验中必须要有镁离子吗？镁离子的作用是什么啊？代谢稳定性研究可以有肝微粒体和原代肝细胞两种试验系统可供选择。如果使用原代肝细胞为试验系统不需要添加镁离子，如果选择肝微粒为试验系统则需要添加镁离子来辅助代谢，镁离子可以有效的提高酶的活性。第十题    代谢产物鉴定实验中孵育时间和酶浓度该如何选择？肝微粒体代谢时间控制在60min(最长不超过2h),肝细胞控制在120min(最长不超过4h),在规定时间内调整酶的浓度，保证生成足量的代谢产物供检测，让药物的剩余量控制在10%~50%的范围内。十一题    代谢稳定性药物浓度一般为1μM，代谢产物鉴定一般10μM，这个浓度如果体内远远达不到该怎么办？代谢稳定性实验的目的是得到半衰期和体外清除率的数据，从而推断体内的清除率。理论上，孵育浓度低至<>1μM，故一般未知化合物都会选1μM进行实验；代谢产物鉴定实验提高化合物的浓度的目的是能够有足量的产物生成而利于产物鉴定。如果体内达不到，可以根据实际情况进行调整。十二题    一相代谢和二相代谢所用的缓冲液是不一样的吗？PBS和Tris缓冲液？有文献报道，对于大多数UGT酶亚型，由于PBS缓冲液会降低其选择性和酶活性，所以二相代谢中选用了Tris缓冲液，故导致了一相代谢和二相代谢所使用的缓冲液有差异。十三题    如果需要同时考察一相和二相代谢，试验系统应如何选择？如果要同时考察一相和二相代谢，选择原代肝细胞作为试验系统是最好的选择。原代肝细胞具有完整的细胞结构，不需要额外添加辅助因子，可以很好的模拟体内的代谢情况。十四题    体外代谢实验需要设计很多对照组，请问对照组是必须的吗？是否可以删减？对照组的目的是考察化合物本身在不同组分中的稳定性，对照组结果稳定是整个代谢实验成立的前提条件。十五题    0min的代谢点总是会发生代谢反应，该如何处理？建议先加入终止液，再启动代谢反应。十六题    化合物在有机溶剂中可以检测到，但加入孵育体系后检测不到？初步判定可能是化合物在水相中溶解度不好或者化合物在水相环境中易水解导致的。若是由于在水相中溶解度不好导致，可优化样品前处理过程；若相同浓度化合物在水溶液和有机溶剂的响应相差50%以上，判定化合物易水解（0.1M PBS对某些化合物而言，可能存在基质效应，判定前需排除基质效应影响），不易进行体外代谢实验，建议确认化合物发生药效是化合物本身还是其水解产物。十七题    有机溶剂的加入对实验结果有什么影响？孵育体系中有机溶剂的含量要控制在1%以内。孵育体系中发挥代谢作用的组分是酶，而酶的本质是蛋白，有机溶剂加入过多，会导致酶变性，活性降低或丧失，故孵育体系中要控制有机溶剂的加入量。十八题    磷酸盐缓冲液的目的是什么啊？为什么要磷酸根呢？磷酸盐缓冲液的目的是模拟生理环境，磷酸根是维持体内体液环境最重要的缓冲对之一，故选择了磷酸根。体外药代动力学研究热点问题与解答-系列一 Q：在代谢稳定性研究中，肝微粒体&肝细胞?该如何选择? A：在代谢稳定性研究中，选肝微粒体还是选肝细胞，主要还是要看化合物的代谢特性，谁 代谢速率高选谁。一般情况下，优先选用肝微粒体，尤其是在化合物分子水溶性较强、、一相 代谢为主要代谢途径(尤其是经由CYP)等情况下，肝微粒体为最优选择。当有证据显示 二相代谢为主要途径、水解作用为主要代谢途径、肝微粒体中非特异性蛋白结合很高、肝微 粒体中代谢不明显的时候，可使用肝细胞进行试验。 Q：代谢稳定性实验中微粒体浓度是考察过的吗?过高或过低有什么影响呢? A： 在代谢稳定性试验中，通常选择的微粒体蛋白浓度为 0.1mg/mL~1mg/mL，具体选用多 大蛋白浓度需根据化合物自身代谢特性去选择。微粒体蛋白浓度过高，会导致药物和微粒体 蛋白非特异性的结合；而微粒体浓度过低，则可能导致药物的代谢不明显。 Q：非特异性蛋白结合对试验结果有什么影响? A：药物分子在孵育体系中是可以与微粒体蛋白结合的。蛋白浓度越高，游离分数的 fu 值 越小，就会造成实测 Clint 值与理论上的“真值”差异越大(实测值比理论值小)。必要时，可 以通过测定孵育体系中的 fu 值进行校正。 Q：药物只做一相代谢可代谢10%，只做二相代谢也只代谢10%，但使用二相代谢试剂盒 却可代谢50%，如何解释? A：药物的生物转化，分为一相代谢反应和二相代谢反应。药物在一相代谢反应中主要发生 氧化、还原和水解的反应，经过一相代谢反应，药物可能带有一些极性基团，如羟基、羧基 等。二相代谢，又称结合反应，一相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子发生 结合，使药物毒性、活性降低或极性增加而易于排出的反应。一般来说，药物先进行一相反 应进行转化，如果极性依然较弱，则会启动二相反应，但有些药物可直接进行二相反应。所 以，才会有以上现象的存在。 Q：半衰期和清除率怎么计算? A： 将受试物在0min 浓度作为 100%，各时间点的受试物浓度与 0min 浓度相比得到剩余百 分数。各时间点的受试物剩余百分数的自然对数与孵育时间经线性回归，求得斜率(k)，由 公式求得各种属微粒体中的消除半衰期t1/2和体外肝微粒体中的固有清除率 Clint in vitro。 Q：原代肝细胞代谢稳定性实验细胞密度推荐多少?清除率计算和肝微粒体一样的吗? A：原代肝细胞代谢稳定性实验推荐的细胞密度为 0.5~2×106个/mL，清除率计算和肝微粒体 代谢稳定性实验的结果处理方法是一致的。 Q：代谢稳定性研究试剂盒中阳性底物的作用是什么?孵育时间点应如何设置? A：试剂盒中阳性底物的作用主要是为了证实试剂盒的有效性。孵育时间点的设置主要看是 基于什么试验目的，若只是为了验证孵育系统是否正常工作，仅需设置0点和一个非零时 间点即可；若需考察阳性底物的代谢稳定性特征，则需设置0点和3~5个非零时间点。 Q：肝微粒体试验中，孵育时是否要开盖保证有氧气的参与? A：理论上来讲，一相代谢反应是有氧反应，需要有氧气的供应，我们内部曾做过验证，孵 育时开不开盖对结果没有影响。 Q：代谢稳定性试验中必须要有镁离子吗?镁美离子的作用是什么啊? A：代谢稳定性研究可以有肝微粒体和原代肝细胞两种试验系统可供选择。如果使用原代肝 细胞为试验系统不需要添加镁离子，如果选择肝微粒为试验系统测需要添加镁离子来辅助代 谢，镁离子可以有效的提高酶的活性。 Q：代谢产物鉴定实验中孵育时间和酶浓度该如何选择? A：肝微粒体代谢时间控制在60min(最长不超过 2h)，肝细胞控制在120min(最长不超过 4h)，在规定时间内调整酶的浓度，保证生成足量的代谢产物供检测，让药物的剩余量控制在 10%~50%的范围内。 Q：代谢稳定性药物浓度一般为1pM，代谢产物鉴定一般10pM， 这个浓度如果体内远远达 不到该怎么办? A： 在代谢稳定性试验的目的是得到半衰期和体外清除率的数据，从而推断体内的清除率。理论上，孵育浓度低至<>1uM， 故一般未知化合物都会选 1uM 进行实验；代谢产物鉴定实验提高化合物的浓度 的目的是能够有足量的产物生成而利于产物鉴定。如果体内达不到，可以根据实际情况进行 调整。 Q：一相代谢和二相代谢所用的缓冲液是不一样的吗? PBS 和 Tris 缓冲液? A：有文献报导，对于大多数 UGT酶亚型，由于 PBS缓冲液会降低其选择性和酶活性，所 以二相代谢中选用了 Tris 缓冲液，故导致了一相代谢和二相代谢所使用的缓冲液有差异。 Q：如果需要同时考察一相和二相代谢，试验系统应如何选择? A：如果要同时考察一相和二相代谢，选择原代肝细胞作为试验系统是最好的选择。原代肝 细胞具有完整的细胞结构，不需要额外添加辅助因子，可以很好的模拟体内的代谢情况。 Q：体外代谢实验需要设计很多对照组，请问对照组是必须的吗?是否可以删减? A：对照组的目的是考察化合物本身在不同组分中的稳定性，对照组结果稳定是整个代谢试 验成立的前提条件。 Q： 0min 的代谢点总是会发生代谢反应，该如何处理? A：建议先加入终止液，再启动代谢反应。 Q：化合物在有机溶剂中可以检测到，但加入孵育体系后检测不到? A：初步判定可能是化合物在水相中溶解度不好或者化合物在水相环境中易水解导致的。若 是由于在水相中溶解度不好导致，可优化样品前处理过程；若相同浓度化合物在水溶液和有 机溶剂的响应相差50%以上，判定化合物易水解 (0.1M PBS 对某些化合物而言，可能存在 基质效应，判定前需排除基质效应影响)，不易进行体外代谢试验，建议确认化合物发生药 效是化合物本身还是其水解产物。 Q：有机溶剂的加入对试验结果有什么影响? A：孵育体系中有机溶剂的含量要控制在1%以内。孵育体系中发挥代谢作用的组分是酶， 而酶的本质是蛋白，有机溶剂加入过多，会导致酶变性，活性降低或丧失，故孵育体系中要 控制有机溶剂的加入量。 Q：磷酸盐缓冲液的目的是什么啊?为什么要磷酸根呢? A：磷酸盐缓冲液的目的是模拟生理环境，磷酸根是维持体内体液环境最重要的缓冲对之一，故选择了磷酸根。