EXODUS分离血液细胞外囊泡用于急性胰腺炎的快速诊断和分级

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在进行蛋白质组学分析之前，作者根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）的指导原则，通过NTA、 WB和TEM对通过EXODUS分离的血浆EV进行了评估。结果显示，分离得到的血浆EV粒径分布在30-200nm尺寸范围内，峰值在105 nm；WB分析结果显示，分离后的产物能表达经典的EV蛋白: Flot-1, CD9，Mac-2BP；TEM结果显示，血浆EV呈现典型的茶托状。后续采用自下而上的策略基于无标记的LC-MS/MS进行EV蛋白质组学，并使用MALDI-TOF MS检测完整EV的指纹，以检测和明确潜在的AP诊断和分级的生物标志物。基于自下而上的蛋白质组学分析，从HC、MAP、SAP三类人群中一共鉴定到479个EV蛋白。为了实现AP精确诊断和快速分级，需要进一步确认EV蛋白在生物学上与AP表型是否具有密切的联系，为此本研究利用人类蛋白质图谱数据库(https://www.proteinatlas.org)对三个组的蛋白都进行了组织溯源和细胞定位。研究发现，血浆EV蛋白主要与肝、淋巴组织以及参与消化的肠、胃和胰腺等组织器官关系密切。为进一步探究细胞类型的来源，从细胞定位数据中发现EV蛋白主要与血液和免疫细胞(如T细胞、巨噬细胞、单核细胞和浆细胞)以及特化上皮细胞，包括胰腺细胞、肝细胞、近端肾小管细胞相关。EV蛋白的溯源分析表明，血浆EV的来源与免疫系统和消化系统密切相关，能够反映人体生理和病理状态的变化，是理想的研究对象。为了进一步从差异蛋白中筛选出候选蛋白，基于Mfuzz方法对HC、MAP、SAP三个组所共有的EV蛋白（419个）进行了表达模式聚类分析。最终，从这四个簇中选择FC值最大的差异蛋白作为候选标志物。这四个蛋白分别为:防御素α1(DEFA1), 纤维连接蛋白(FN1), 单核细胞分化抗原CD14(CD14)，血清淀粉样蛋白A-1(SAA1)。其中簇1-3中的DEFA1, FN1, CD14是AP严重度评估的潜在候选标志物，簇4中的SAA1是AP诊断的潜在候选标志物。值得注意的是SAA1同时是MAP组和SAP组分别相对于HC组来说FC值最大的差异蛋白。通过自下而上的蛋白质组学已经确定了4个候选标志物，接着将结合自上而下的蛋白质组学分析，以达到两种方法相互验证、相互补充和更加全面地解析与AP发生和进展密切相关的关键EV蛋白的目的。通过EXODUS设备快速分离得到HC组、MAP组、SAP组的血浆EV，再通过MALDI-TOF快速、高通量地获取三类人群的完整EV的蛋白指纹图谱。从蛋白指纹图谱的差异峰中可以选择能反映AP发生和进展的差异峰作为潜在生物标志物。分析发现 SAA 蛋白及其亚类(SAA1-1、desR-SAA1-2、SAA2、SAA1-2) 在快速诊断 AP 的性能上 AUC 高达 0.92 - 0.97。进一步运用了免疫电镜技术交叉验证SAA在EV表面的表达。研究结果显示，抗SAA抗体(包括SAA1和SAA2)标记的10 nm金颗粒更倾向于出现在AP患者的EV表面，而不是HC个体EV表面。因此，基于EXODUS快速分离血浆EV和基于MALDI-TOF快速检测血浆EV蛋白的方法是探究血浆EV蛋白在AP发生时身体机能变化的关键利器。通过SAA在血浆EV中表达水平的变化，可以实现AP的精确诊断。