基于单细胞(Single Cell)-ICP-TOF-MS对微藻-重金属吸收&吸附行为进行精准表征

智能文字提取功能测试中

基于单细胞(Single Cell)-ICP-TOF-MS对微藻-重金属吸收&吸附行为进行精准表征藻类作为生态系统中的初级生产者，其细胞膜的选择性以及细胞壁上丰富且排列合理的官能团，使得其对重金属有很强的富集能力。在藻类吸收/吸附重金属的研究中，传统方法多通过ICP-MS分析消解后的微藻溶液，而单个细胞所特有异质性无法在测试数据中获得表征。单细胞-电感耦合等离子体质谱法(SC-ICP-MS)是在单颗粒技术(SP-ICP-MS)的基础上进行迭代演化而来，目前逐渐成为单细胞事件分析的重要技术手段之一(如质谱流式，Mass Flow)。对于在单细胞瞬态信号中进行多元素多质荷比分析的技术需求方面，相比于传统的四极杆质谱，电感耦合等离子体飞行时间质谱(ICP-Q-TOF-MS)具有显著优势，其可提供微秒级别的扫描速度，单次push即可提供全谱数据，且对目标质荷比数量没有限制，这种特有的快速全谱数据采集能力在处理单细胞分析时尤其重要(图1)。在本项工作中，详细展示了利用谱育科技EXPEC 7910型ICP-Q-TOF-MS从单细胞尺度上探讨了同一微藻对不同金属以及不同微藻对相同金属的吸附/吸收行为差异，以期为微藻与重金属的相互作用等领域提供新兴的技术支持。藻类作为生态系统中的初级生产者，其细胞膜的选择性以及细胞壁上丰富且排列合理的官能团，使得其对重金属有很强的富集能力。在藻类吸收/吸附重金属的研究中，传统方法多通过ICP-MS分析消解后的微藻溶液，而单个细胞所特有异质性无法在测试数据中获得表征。02谱育科技-单颗粒分析专用软件介绍本项工作中所涉及的单细胞信号采集与数据处理等方面的技术细节与单颗粒的技术需求较为一致，因此本项工作中的数据处理工作，均依赖谱育科技发布的“单颗粒数据处理专用软件”实现，其包含事件数据处理(背景阈值算法、瞬态事件识别的多重算法、细胞/标记信号整合、传输效率计算等)、瞬态事件数据解析等多重核心功能。单颗粒数据分析软件主界面示意如图2所示。材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验微藻选择小球藻和卵囊藻作为实验对象(图3)，置于250 ml锥形烧瓶中的BG11培养基，在室温下在以120 μEm−2 s−1的平均强度连续光照下孵育到指数生长期。2.1.2 实验模拟废水实际废水中污染物种类繁多、化学性质复杂，为了避免对实验结果产生干扰，本研究采用实验模拟废水来排除实际废水中其他成分的影响。具体操作是在经过所用的药品为分析纯试剂，无需额外对其进行纯化处理，试液配制均采用超纯水作为主要溶剂。首先配制 Cd、Hg、Pb(水体中常见的重金属污染)以及La(稀土元素)浓度为 1g/L 的金属储备溶液，置于 4°C 下避光保存，通过计算需要加入重金属储备溶液的体积，得到实验所需浓度的重金属废水。2.2 实验方法2.2.1 微藻对单一金属的吸附/吸收行为新鲜培养基稀释微藻，用血细胞计数板计数约为107。实验开始前调节藻液pH至6.0避免重金属离子沉淀。将30 mL小球藻和卵囊藻分别与重金属单个金属溶液孵育，培养箱中孵育完成后，在5000 rpm下离心5分钟，弃上清液(Merrifield R C))。用超纯水洗涤微藻，离心、弃上清。将清洗后的微藻用超纯水稀释至适当浓度。涡旋30 s后，ICP-Q-TOF-MS上机测试(图4)。2.2.2 微藻对混合金属的吸附/吸收行为30 mL小球藻和卵囊藻分别与重金属混合溶液孵育。孵育完成后，在5000 rpm下离心5分钟，弃上清液。用超纯水洗涤微藻，离心、弃上清。将清洗后的微藻用超纯水稀释至适当浓度。涡旋30 s后，ICP-Q-TOF-MS上机测试(图4)。2.2.3 对比实验除了用ICP-Q-TOF-MS测试微藻细胞外，我们还分别用SC-ICP-MS和ICP-MS测藻细胞和消解后的微藻。仪器运行条件本实验仪器采用谱育科技EXPEC 7910型ICP-Q-TOF-MS，样品引入系统包括2.5mm内径的石英矩管、石英微流雾化器、200℃全耗型加热雾室、Ni采样锥和Ni截取锥，样品以气动泵、全耗型方式进行提取，采用60 nm Au纳米颗粒作为校正参考物质。ICP-Q-TOF-MS可以瞬时采集全谱信号并输出数据结果，在单颗粒数据采集模式进行扫描，并输出111Cd、139La、202Hg、208Pb同位素信号结果。结果讨论①微藻对单一金属的吸附/吸收行为图5为单颗粒模式采集微藻(以小球藻为例)分别吸附四种金属同位素(Cd、La、Hg、Pb)的实时质谱图(3 min)中均显示明显纳米颗粒信号脉冲。ICP-MS、SP-ICP-MS和ICP-Q-TOF-MS分析小球藻和卵囊藻吸附/吸收单一金属的质量，结果如图6所示。利用传统的方法(ICP-MS)确定微藻对金属的吸附，需要对细胞进行酸解，获得微藻对金属的平均吸附量(A、D)；SP-ICP-MS能获得单个微藻对金属的吸附信息，但每次只能检测一种元素(B、E)；ICP-TOF-MS不仅能分析单个微藻，而且一次测量就能获得所有元素的信息，显著减少了测量时间及样品损耗(C、F)。箱型图在单个细胞层面上进一步展示了小球藻和卵囊藻对4种金属的吸附量(图7B、D)，两种藻类的吸附行为具有显著差异。小球藻对Cd、Hg的吸附量高于卵囊藻，而卵囊藻对La、Pb的吸附量大于小球藻。除此之外，因细胞的异质性，使相同的微藻在吸附同一金属时，其吸附量也存在差异，这些现象为后续研究微藻结构等提供数据支持。自然界中的污染物通常具有综合性的特点，研究单一污染物虽然具有一定的参考价值，但对实际水体的污染风险评估作用不大，因此对混合污染物之间的联合作用方式的研究十分必要。在这里，我们将等量的Cd、Hg、La、Pb混合，将混合溶液分别与小球藻和卵囊藻孵育，从图8A、C可以看出，将小球藻或卵囊藻与等量的多元素同时孵育，同种藻的吸附行为也不一致，大部分只能吸附一种金属或两种金属，仅部分能同时吸附多种金属；图8 B、D是小球藻和卵囊藻同时吸附4种金属时，每个微藻细胞的具体吸附展示，其行为与吸附单个金属也同样发生了变化，详细变化信息可以被ICP-Q-TOF-MS深度量化。在单个金属元素或混合金属溶液中，微藻对同种金属的吸量存在明显差异。对于小球藻，混合元素的存在抑制了小球藻对Cd的吸收，显著促进了对La的吸收；对于卵囊藻，混合元素的存在促进了微藻对La、Hg、Pb的吸收，抑制对Cd的吸收(图9)。总结本文成功基于单细胞-电感耦合等离子体飞行时间质谱，建立了藻类与重金属吸收/吸附行为的表征方法。通过对微藻吸附重金属量的研究，SC-ICP-TOF-MS的分析数据揭示了不同藻类与不同重金属吸附行为的显著差异以及再混合重金属体系下，元素之间存在相互促进或抑制行为。基于单细胞分析技术，ICP-TOF-MS所具备的技术特点，可实现单细胞层面上微藻对金属的吸附/吸收行为研究，为微藻在处理环境水体中重金属污染等实际应用方面建立理论基础。 参考文献Merrifield R C , Stephan C , Lead J R .Quantification of Au Nanoparticle Biouptake and Distribution to Freshwater Algae Using Single Cell – ICP-MS[J]. Environmental Science and Technology, 2018, 52(4): 2271-2277. DOI: 10.1021/acs.est. 7b04968.