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【求助】请教！熟悉“考马斯亮蓝测定蛋白质浓度”的朋友请进

gaona306

2008/02/28

紫外可见分光光度计（UV）

大家好，请教各位一个问题：
　　文献报道，考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
　　但我按照文献配制的G－250（0.1mg/mL）是紫色的，用紫外光谱检测时超出量程，所以用二次水稀释一倍，检测其最大吸光度值，不在488nm，将其和一定浓度的牛血清白蛋白结合，发现其颜色并未变成青色，吸光度也不在595nm，而是随着蛋白浓度的增加红移。实验现象与文献完全不同，不知道是哪里出错了，请教各位！
　　很着急，请知情人解答疑惑，万分感谢！

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gaona306

第1楼2008/02/28

自己顶一下！呵呵

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gaona306

第2楼2008/02/28

在线等待，谢谢大家！

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意境

第3楼2008/02/28

你配制的过程是否有问题啊？比如，是否溶解完全后转移并定容的？我记得是用磷酸和乙醇溶解后，定容稀释的，如果前面没有溶解完全并且过滤的话，可能会有些问题，即使加了蛋白质也不会太好，不过我记得当初我家蛋白质后，浓度大时好像成的是蓝色。
你可以仔细的配一次考马斯亮蓝，一定要保证全溶！！

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zam0825

第4楼2008/02/29

你可以参考一下这个试验
http://etc.sjtu.edu.cn/xdshsy/syjc/jcsy/syjc3/sy9.htm

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东方王

第5楼2008/03/05

我们遇到过同样问题，不同厂家的试剂效果不一样。换试剂试试
gaona306 发表:大家好，请教各位一个问题：
　　文献报道，考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
　　但我按照文献配制的G－250（0.1mg/mL）是紫色的，用紫外光谱检测时超出量程，所以用二次水稀释一倍，检测其最大吸光度值，不在488nm，将其和一定浓度的牛血清白蛋白结合，发现其颜色并未变成青色，吸光度也不在595nm，而是随着蛋白浓度的增加红移。实验现象与文献完全不同，不知道是哪里出错了，请教各位！
　　很着急，请知情人解答疑惑，万分感谢！

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wangqk198738

第6楼2008/04/04

方法不对，你再配制考马斯亮蓝的时候，应该尽量保持无菌状态。所有的东西要用酒精清洗，盛装考马斯亮蓝的瓶子最好是棕色的，并且就用你盛装酒精的就行啊。不用洗。不要加水。我费了老大劲给你弄这东西。得申请阿麻烦死了。不懂再问吧

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yxywj01

第7楼2008/04/04

现在有问题的试剂太多，我们单位进货的只看价格不看质量，可害苦我们了
ydwhd 发表:我们遇到过同样问题，不同厂家的试剂效果不一样。换试剂试试

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初学者&九点虎

第8楼2008/04/04

俺们是用开始定单做的

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vicou_chen

第9楼2008/04/09

找到同道的了，我最近也正在进行蛋白浓度的测定，不过我所使用的考马斯亮兰G－250是南京建成试剂研究所配制好的，加水稀释后可直接使用，我测过稀释液的最大吸收波长，文献报道是465nm，我测出来后在465～468之间，可以说这个波长差异还算是正常的。
另外，据我所看到的资料，考马斯亮兰G－250有两种状态，对应两种最大吸收波长：在酸性游离的条件下，呈茶色，最大吸收波长在465nm；而和牛血清蛋白结合后，最大吸收波长在595nm。根据试剂盒随带的牛血清蛋白标准溶液结合后的测定结果发现，最大吸收波长在596～598nm左右，应该说跟文献上所说的相差不大。

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