一道黑
第1楼2008/12/02
9. 分析步骤
有些实验步骤使用c.q. sublitizin消化方法做样品前处理，而另一些实验步骤使用超声波提取获得肝样的提取物。根据RIVM的研究，两种前处理方法处理动物所获得的试样，分析结果没有表现出明显的差别。超声波方法比较简单，干扰化合物比较少，应该优先采用。
9.1 提取步骤
9.1.1 动物饲料
准确称取10.0g动物饲料于玻璃烧瓶中，加入50.0mL水。将烧瓶放入超声波水浴中提取30分钟。接下来振摇或涡流烧瓶约10秒钟，然后将烧瓶离心10分钟（1800g），从中移取19mL放入一个清洁的烧瓶中，用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到9.8±0.2，然后加水到体积为20mL。
9.1.2 肝
准确称取10.0g肝于一个20mL的玻璃烧瓶中，加入15mL浓度为0.01mol/L的盐酸，将烧瓶放入超声波水浴中提取15分钟。接下来振摇或涡旋混匀烧瓶约10秒，然后将烧瓶离心10min（1800g），然后滗出上清液于一个清洁的烧瓶中。用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到5.2±0.2，然后加水到体积为20mL。
9.1.3 尿
准确移取10.0mL尿液于一个20mL的玻璃烧瓶中，用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到5.2±0.2，然后加水到体积为20mL。
9.2 加酶水解
上述尿样及肝的初始提取样液加酶水解，即往水溶液样品中加入0.1mL的Helix Pomatia（6.1.22），然后全部样品于37℃被孵化过夜。将孵化后的样品冷却到室温后，调节pH值到9.2±0.2，之后样品的体积用水调节到20mL。
9.3 Extrelut提取
经上述步骤处理的各样液（均为20mL），放入一台Extrelut提取离心机中。离心平衡15分钟后，用60mL乙酸乙酯提取水溶液，之后将提取液放入旋转蒸发器上于50℃蒸发。
9.4 样品净化；免疫亲合力色谱
首先用至少10mL的水洗涤免疫亲合力色谱柱（IAC柱），然后用0.1mL的乙醇溶解旋转蒸发残渣，再加入50mL水并将烧瓶放入超声波水浴中至少1分钟，使残渣得到充分溶解。该水溶液被加入IAC柱，并以2mL/min的流量流过IAC柱。然后用5mL免疫亲合力色谱缓冲液（IAC缓冲液）洗出β-激动剂，再用5mL水洗涤色谱柱。合并洗出液，然后放在50℃的水浴上通冷的氮气流蒸发至干。免疫亲合力色谱柱（IAC柱）依次用5mL IAC缓冲液，25mL水和25mL PBS进行洗涤，可以使柱子得到再生。
9.5 免疫亲合力色谱洗脱物（IAC洗脱物）的脱盐处理
上述蒸发得到的干残渣用0.5mL的乙醇再次制成悬浮液，然后在4℃离心（1800g）5分钟，上清夜被转移至衍生反应玻璃小瓶中，用加热块在50℃加热通冷氮气流的条件下，使乙醇蒸发干。
9.6 衍生化反应
上一步的蒸发残渣用0.1mL衍生化试剂溶解（6.1.21），混合物于60℃孵化1小时（7.12），然后蒸发至干，干衍生残渣用0.025mL甲苯溶解（6.15），然后甲苯溶液转移至另一个衍生反应玻璃小瓶中（7.10），准备接受GC-MSD分析和确证实验（10.1）。
GC-MSD测试条件的设置：
进样体积： 2μL
进样温度： 260℃
进样方式： 不分流进样
初试温度： 70℃
升温梯度： 25℃/min
第一恒温点： 200℃（6 min）
升温梯度： 25℃/min
第二恒温点： 300℃（2 min）
监测离子(选择性检测)： m/z=86（叔丁基-β-激动剂）
m/z=72（异丙基-β-激动剂）
10. 结果计算
结果计算所使用的步骤（定量化），与用内标法或外标法有关。用同位素标记的标准物质获得的校正曲线，是一条直线，它用标准物质的离子强度对内标物质的离子强度的比率作为因变量，标物质的浓度作为自变量，进行最小二乘法拟合运算而获得。用这些步骤产生的线性校正曲线，离原点的截距非常小。其它β-激动剂的定量化线性程度不是很好，然而它们在肌肉内和肝中的回收率与克喘素的回收率几乎是相等的。回收率有明显差别的唯一的化合物是舒喘灵，然而为这一化合物而使用的内标物是有效的（参看validation一节）
为了证实至少有4种离子的响应值可以同时测定出来，就有必要对标准物和未知化合物都进行计算。
10.1 确证实验
为确证β-激动剂另附一些β-激动剂的碎片离子并列表如下。它们是按照离子强度的次序（A到F）进行表示的。
N M.W M.WD. [A] [C] [D] [E] [F]
_
特普他林 3 225 441 86 356 336 426 370 280
沙丁胺醇 3 239 455 86 369 350 440 384 294
克喘素 1 276 348 86 262 243 333 277 187
_雪马特罗 1 219 291 72 219 186 276 234
2 219 363 72 291 258 348
_马本特罗 1 310 382 86 296 277 367 311 221
式中：N=TMS-基团的数目；M.W.=纯化合物的分子量；M.WD=衍生反应后的分子量。
根据欧共体标准（EC-criteria）的要求， 至少有4种离子要进行监控。每一种离子的`响应值，其最大值应该达到至少超过平均噪音的 3倍标准偏差（ 3D）的要求。如果达到了这一标准，全部被监控的离子就可以按照3种不同的比率来进行计算。对标准分析物来说，在相应的浓度范围内，更适合以相同的比率来进行计算。对鉴定为阳性结果的未知样品，应该要求它们的响应值，全部落在标准物响应平均值的 10 的范围内。
注意：由于质谱设备经常发生波动，因此无法保证严格执行此标准。鉴于此，可以用一种考虑了实验波动性的标准来替代此标准。替代标准中未知样品的响应值比率，应该在相应标准物响应值比率 3倍标准偏差范围内。
10.1.1 -激动剂的碎片图（参看下图 1）
10.2 确认
过去所承担的许多研究，都是为了确认实验步骤的。这些研究实验的大多数都是在实验室范围内适用（即在实验室内具有重复性和再现性）。欧共体在RIVM.的实验工作机构，在1991年4月22日到26日几天之间，除了确认实验方法以外，还负责组织和论证有关动物饲料方面的合作研究。
10.2.1 免疫亲合力色谱（IAC）实验阶段的分析回收率
每一批新制备的免疫亲合力色谱（IAC）实验材料，是否能适用于实验，必须要对它保留有关组分的容量进行测试来决定。下面是几个典型测试实验的结果（所用测试化合物的量为200 ng）：
化合物名称 IAC阶段的回收率(％)
克喘素 95
马本特罗 111
沙丁胺醇 103
雪马特罗 96
10.2.3 整个实验的回收率
在论证免疫亲合力色谱（IAC）实验材料的时候，必须对添加到空白尿样中的各个被侧组分，进行回收率的测定实验来确认。只有在确认实验完成之后，才允许添加内标物来对衍生反应及以后的GC-MS测定作校正分析。
化合物名称 IAC阶段的回收率(％)（平均值 标准偏差，N=2）
克喘素 102 8
马本特罗 115 4
沙丁胺醇 56 5
雪马特罗 100 5
10.2.4 重复性和再现性
重复性和实验室内的再现性，是用克喘素和沙丁胺醇做分析实验确定的，样品来自用药动物的尿和肝(小牛的尿和猪的肝）。样品分三次进行，每次做平行样品。
肝中的沙丁胺醇
单次测定值( g/kg) 实验内偏差 实验间偏差
3.6 3.3 S2=0.016 S2=0.065
3.4 3.3 S=0.13 S=0.25
3.7 3.7 RSD=3.7 RSD=3.7
肝中的克喘素
单次测定值( g/kg) 实验内偏差 实验间偏差
13.8 11.2 S2=1.31 S2=2.63
12.9 12.6 S=1.14 S=1.62
15.1 14.1 RSD=8.5 RSD=12.1
尿中的克喘素
单次测定值( g/kg) 实验内偏差 实验间偏差
4.4 4.3 S2=0.035 S2=0.122
4.2 4.6 S=0.19 S=0.35
4.7 4.9 RSD=4.2 RSD=7.8
尿中的沙丁胺醇
单次测定值( g/kg) 实验内偏差 实验间偏差
2.0 2.0 S2=0.007 S2=0.020
1.8 2.0 S=0.08 S=0.14
2.1 2.1 RSD=4.0 RSD=7.0
10.2.5 灵敏度
灵敏度取决于是否使用了选择性监测离子方法，但选择性监测只能对丰度最大2种离子（m/z=86或72）进行监测。但对于4种离子都必须进行监测的确认实验而言，也要使用选择性监测离子方法。不过后者的灵敏度会降低，将降到4种离子的最低检测线。
一道黑
第2楼2008/12/02
9. 分析步骤
有些实验步骤使用c.q. sublitizin消化方法做样品前处理，而另一些实验步骤使用超声波提取获得肝样的提取物。根据RIVM的研究，两种前处理方法处理动物所获得的试样，分析结果没有表现出明显的差别。超声波方法比较简单，干扰化合物比较少，应该优先采用。
9.1 提取步骤
9.1.1 动物饲料
准确称取10.0g动物饲料于玻璃烧瓶中，加入50.0mL水。将烧瓶放入超声波水浴中提取30分钟。接下来振摇或涡流烧瓶约10秒钟，然后将烧瓶离心10分钟（1800g），从中移取19mL放入一个清洁的烧瓶中，用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到9.8±0.2，然后加水到体积为20mL。
9.1.2 肝
准确称取10.0g肝于一个20mL的玻璃烧瓶中，加入15mL浓度为0.01mol/L的盐酸，将烧瓶放入超声波水浴中提取15分钟。接下来振摇或涡旋混匀烧瓶约10秒，然后将烧瓶离心10min（1800g），然后滗出上清液于一个清洁的烧瓶中。用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到5.2±0.2，然后加水到体积为20mL。
9.1.3 尿
准确移取10.0mL尿液于一个20mL的玻璃烧瓶中，用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到5.2±0.2，然后加水到体积为20mL。
9.2 加酶水解
上述尿样及肝的初始提取样液加酶水解，即往水溶液样品中加入0.1mL的Helix Pomatia（6.1.22），然后全部样品于37℃被孵化过夜。将孵化后的样品冷却到室温后，调节pH值到9.2±0.2，之后样品的体积用水调节到20mL。
9.3 Extrelut提取
经上述步骤处理的各样液（均为20mL），放入一台Extrelut提取离心机中。离心平衡15分钟后，用60mL乙酸乙酯提取水溶液，之后将提取液放入旋转蒸发器上于50℃蒸发。
9.4 样品净化；免疫亲合力色谱
首先用至少10mL的水洗涤免疫亲合力色谱柱（IAC柱），然后用0.1mL的乙醇溶解旋转蒸发残渣，再加入50mL水并将烧瓶放入超声波水浴中至少1分钟，使残渣得到充分溶解。该水溶液被加入IAC柱，并以2mL/min的流量流过IAC柱。然后用5mL免疫亲合力色谱缓冲液（IAC缓冲液）洗出β-激动剂，再用5mL水洗涤色谱柱。合并洗出液，然后放在50℃的水浴上通冷的氮气流蒸发至干。免疫亲合力色谱柱（IAC柱）依次用5mL IAC缓冲液，25mL水和25mL PBS进行洗涤，可以使柱子得到再生。
9.5 免疫亲合力色谱洗脱物（IAC洗脱物）的脱盐处理
上述蒸发得到的干残渣用0.5mL的乙醇再次制成悬浮液，然后在4℃离心（1800g）5分钟，上清夜被转移至衍生反应玻璃小瓶中，用加热块在50℃加热通冷氮气流的条件下，使乙醇蒸发干。
9.6 衍生化反应
上一步的蒸发残渣用0.1mL衍生化试剂溶解（6.1.21），混合物于60℃孵化1小时（7.12），然后蒸发至干，干衍生残渣用0.025mL甲苯溶解（6.15），然后甲苯溶液转移至另一个衍生反应玻璃小瓶中（7.10），准备接受GC-MSD分析和确证实验（10.1）。
GC-MSD测试条件的设置：
进样体积： 2μL
进样温度： 260℃
进样方式： 不分流进样
初试温度： 70℃
升温梯度： 25℃/min
第一恒温点： 200℃（6 min）
升温梯度： 25℃/min
第二恒温点： 300℃（2 min）
监测离子(选择性检测)： m/z=86（叔丁基-β-激动剂）
m/z=72（异丙基-β-激动剂）
10. 结果计算
结果计算所使用的步骤（定量化），与用内标法或外标法有关。用同位素标记的标准物质获得的校正曲线，是一条直线，它用标准物质的离子强度对内标物质的离子强度的比率作为因变量，标物质的浓度作为自变量，进行最小二乘法拟合运算而获得。用这些步骤产生的线性校正曲线，离原点的截距非常小。其它β-激动剂的定量化线性程度不是很好，然而它们在肌肉内和肝中的回收率与克喘素的回收率几乎是相等的。回收率有明显差别的唯一的化合物是舒喘灵，然而为这一化合物而使用的内标物是有效的（参看validation一节）
为了证实至少有4种离子的响应值可以同时测定出来，就有必要对标准物和未知化合物都进行计算。
10.1 确证实验
为确证β-激动剂另附一些β-激动剂的碎片离子并列表如下。它们是按照离子强度的次序（A到F）进行表示的。
N M.W M.WD. [A] [C] [D] [E] [F]
_
特普他林 3 225 441 86 356 336 426 370 280
沙丁胺醇 3 239 455 86 369 350 440 384 294
克喘素 1 276 348 86 262 243 333 277 187
_雪马特罗 1 219 291 72 219 186 276 234
2 219 363 72 291 258 348
_马本特罗 1 310 382 86 296 277 367 311 221
式中：N=TMS-基团的数目；M.W.=纯化合物的分子量；M.WD=衍生反应后的分子量。
根据欧共体标准（EC-criteria）的要求， 至少有4种离子要进行监控。每一种离子的`响应值，其最大值应该达到至少超过平均噪音的 3倍标准偏差（ 3D）的要求。如果达到了这一标准，全部被监控的离子就可以按照3种不同的比率来进行计算。对标准分析物来说，在相应的浓度范围内，更适合以相同的比率来进行计算。对鉴定为阳性结果的未知样品，应该要求它们的响应值，全部落在标准物响应平均值的 10 的范围内。
注意：由于质谱设备经常发生波动，因此无法保证严格执行此标准。鉴于此，可以用一种考虑了实验波动性的标准来替代此标准。替代标准中未知样品的响应值比率，应该在相应标准物响应值比率 3倍标准偏差范围内。
10.1.1 -激动剂的碎片图（参看下图 1）
10.2 确认
过去所承担的许多研究，都是为了确认实验步骤的。这些研究实验的大多数都是在实验室范围内适用（即在实验室内具有重复性和再现性）。欧共体在RIVM.的实验工作机构，在1991年4月22日到26日几天之间，除了确认实验方法以外，还负责组织和论证有关动物饲料方面的合作研究。
10.2.1 免疫亲合力色谱（IAC）实验阶段的分析回收率
每一批新制备的免疫亲合力色谱（IAC）实验材料，是否能适用于实验，必须要对它保留有关组分的容量进行测试来决定。下面是几个典型测试实验的结果（所用测试化合物的量为200 ng）：
化合物名称 IAC阶段的回收率(％)
克喘素 95
马本特罗 111
沙丁胺醇 103
雪马特罗 96
10.2.3 整个实验的回收率
在论证免疫亲合力色谱（IAC）实验材料的时候，必须对添加到空白尿样中的各个被侧组分，进行回收率的测定实验来确认。只有在确认实验完成之后，才允许添加内标物来对衍生反应及以后的GC-MS测定作校正分析。
化合物名称 IAC阶段的回收率(％)（平均值 标准偏差，N=2）
克喘素 102 8
马本特罗 115 4
沙丁胺醇 56 5
雪马特罗 100 5
10.2.4 重复性和再现性
重复性和实验室内的再现性，是用克喘素和沙丁胺醇做分析实验确定的，样品来自用药动物的尿和肝(小牛的尿和猪的肝）。样品分三次进行，每次做平行样品。
肝中的沙丁胺醇
单次测定值( g/kg) 实验内偏差 实验间偏差
3.6 3.3 S2=0.016 S2=0.065
3.4 3.3 S=0.13 S=0.25
3.7 3.7 RSD=3.7 RSD=3.7
肝中的克喘素
单次测定值( g/kg) 实验内偏差 实验间偏差
13.8 11.2 S2=1.31 S2=2.63
12.9 12.6 S=1.14 S=1.62
15.1 14.1 RSD=8.5 RSD=12.1
尿中的克喘素
单次测定值( g/kg) 实验内偏差 实验间偏差
4.4 4.3 S2=0.035 S2=0.122
4.2 4.6 S=0.19 S=0.35
4.7 4.9 RSD=4.2 RSD=7.8
尿中的沙丁胺醇
单次测定值( g/kg) 实验内偏差 实验间偏差
2.0 2.0 S2=0.007 S2=0.020
1.8 2.0 S=0.08 S=0.14
2.1 2.1 RSD=4.0 RSD=7.0
10.2.5 灵敏度
灵敏度取决于是否使用了选择性监测离子方法，但选择性监测只能对丰度最大2种离子（m/z=86或72）进行监测。但对于4种离子都必须进行监测的确认实验而言，也要使用选择性监测离子方法。不过后者的灵敏度会降低，将降到4种离子的最低检测线。
一道黑
第3楼2008/12/02
11. 特殊情况
特殊情况的实验步骤中，包含了一步对 -激动剂进行非共轭化处理的特殊操作，此时 -激动剂也许是以葡糖苷酸或葡糖苷酸的磷酸酯的形式而存在的。对克喘素来说，它的全部数据都能够导致不会生成共轭物的结论。对沙丁胺醇来说，它以磷酸酯的形式存在这一点，已经叙述过了。在RIVM的研究还表明，在牛的体内，95％以上的沙丁胺醇是以共轭的形式存在的。所以延长孵化的时间以及增大相关生化酶的量是有必要的。基于这些情况，就可以得出这样一点，即在日常制备多残留样品时，必须执行一种非共轭化处理的特殊操作。而对于克喘素这一特定分析来说，其中的水解步骤是可以省略的。对其它的 -激动素而言，目前还没有可以采用的数据。
12. 方法的注意事项
实验操作步骤的选择，应依据实验试剂、标准品及仪器设备而论。
13. 质量控制、标准品和抗体
关键实验试剂和标准物质的来源情况，在第8节中已进行了叙述。在开会地点RIVM的实验室内，克喘素标样的制备，是将其掺入到牛肝中制成含量为1 g/kg或2 g/kg的，均质的，被冻干的批量样品。使用这些样品做的实验，在添加水平为1 g/kg时，各实验之间的变异系数为13 ，在添加水平为2 g/kg时，各实验之间的变异系数为8.6 ，回收率为85-100 。
13.1 免疫亲合力色谱（IAC）
应根据供应商提供的说明与贮存等有关操作使用。
13.2 免疫亲合力色谱（IAC）柱及其凝胶颗粒
有关试验材料供应商的资料（略）。
13.3 含重氢原子的示踪标准物质
含重氢原子的示踪标准物质被保存在RIKILT。
14. 检测报告
15. 缩略语表（略）
16. 流程图
赛默飞实验室产品焕新计划有奖调研！
【七月征文】不一YOUNG实验“猿”
下周三开幕，iCS2024光谱大会，报名可看回放！
色谱耗材品限时大促，火热进行中！
