【讨论】如何选择液相色谱柱

二聚合物填料
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸至等，其主要优点是在PG值为1-14均可使用。
相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的淑水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。
现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效教低。
三.其他无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新型氧化诰填料也可用于 HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化诰微球色谱柱，应用PH范围1~14，温度可达到1000C。由于氧化诰填料几年才开始研究，加之前的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。

怎样选择填料粒度
目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3,5和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择是真确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料是很用有的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5UM填料的柱效提高近30%；然而；3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱，以缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。

如何保证良好的柱性能与柱寿命
ü ü 认证阅读色谱柱使用说明书
ü ü 使用填充良好的色谱柱；
ü ü 尽量减少压力波动，避免机械及热冲击
ü ü 使用保护柱及在线过滤器
ü ü 经常以强溶剂冲洗色谱柱
ü ü 充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与保强留分成
ü ü 用稳定的固定相（C18最稳定）
ü ü 在中等PH纸操作（6~8），用有机年成液溶；
ü ü 色谱柱使用温度最好小于400C
ü ü 硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0
ü ü 在水流动相与缓冲浓液中加200ppm的叠氮钠
ü ü 流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%
ü ü 过夜或储存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴最好）.。

HPLC固定相及应用范围、

姓名 性别 功能基团 正相 反相 离子对 应用
Silica -OH √ 非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。
SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留最弱，典型用于中等极性和多官能团化合物
Buty1 C4 -C4H9 √ √ 分离肽和蛋白质，保留时间比C8和C18短
MOS C8 -C4H9 √ √ 中等极性相中对中等化合物，小肽和蛋白质，极性药，0族化合物和环境样品
ODS C18，O √ √ 烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。广泛用于药物，0族化合物，脂肪酸和环境样品
CPS CN ，C √ √ 对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相分离，当用于反相系统时，其选择性与C8和C18不同，在药学领域和复杂混合物的分离中应用广泛。
APS NH √ √ 反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和机改性剂做流动相，正相中与硅胶的选择性不同，分析芳香族效果很好
芳香族化合物
PD 反向时，分离胎和蛋白质。正相时，与硅选择性相似
SCX 强阳离子交换 有机碱
SAX 强阴离子交换 有机酸，核苷和核苷酸
如何解决色谱柱使用过程中出现的问题

一．保留值与分离度重现性不好原因分析

问题 原因 表现
不同色谱柱间差异使用期间柱的变化 填料，键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解，强保留分堆积堵塞 保留因子（K）分离子（）柱效（N）
保留因子（K）柱效（N）
柱外效应 系统差易，进样量大，进样0与色谱柱之间，色谱柱与检测器之间管路太长，检测器流通池体积大，接头死体积大等 注效（N）
分离效果变差 流动相组分改变 保留因子（K）柱效变化很小
流速改变 保留因子（K） 分离因子
温度改变 保留因子（K）柱效变化很小
柱平衡慢 重新平衡时间不够 保留因子（K）柱效变化很小
柱超载 样品量太大 保留因子（K） 注效（N）

二 、造成色谱峰（不对称）拖尾的原因
1.色谱柱本身填装问题，筷板堵塞或填料塌陷
2.柱头有污染；
3样本超载；
4样品溶剂不合适]
5.柱外效应
6化学或二次保留（硅基）效应
7缓冲容量不足或不合适
8重金属污染

三、如何解决峰形拖尾的问题
A. 与化学有关的拖尾问题
1 .流动相中，加入30MM的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸胺（用与酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺
2如然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；
3.降低进样量至〈1UG。
B．与色谱柱有管的拖尾问题
1如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲醇，家1%氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。
2.使用保护柱
C.与HPLC 系统有关的蜂拖尾和峰加宽
1.进样体积过大，通常〈25UL〉
2.进样0与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应〈20CM，内径为0.007〉
3检测器流通池的体积过大

四、如何储存色谱柱
1防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加200PPM的叠0钠以抑制细菌成长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中家20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。
2.尽可能将色谱柱储存于100%有机溶剂（乙晴最好）中，避免在缓冲溶液中保存。
3.使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15`20陪柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂储存。
4避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱。
5将色谱柱的两端用堵有拧好，以免柱床填料干裂。

五、如何选择保护柱
怎样选择保护柱，但又不能影响分离分析？这是色谱工作者经常提出的一 个问题。通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。对于大部分分析工作者来说，一只1CM
长的保护柱，那么就应选择2CM或3CM长的保护柱，保护柱越长，自然所装添的色谱柱的机会。当然，随着保护柱的长度加长，样品的保留时间会比使用短保护柱长。一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。
保护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱，使用过程很简单方便，而且可以在实验室中进行干装。但是，其最大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护拄所装填的色谱填料有限，只能提供有限的保护作用。不过也因为所装填的色谱料较少，保护柱的长度也教短，所以对分析样品的保留时间的影响也很小。
另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析拄，设计方式上有直连式、手紧式或整替式。整体式设计是有色谱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候有色谱工作着来安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱长度。手上紧即可。另外从保护柱结构又分为是否可以更换保护柱柱芯，可以降低保护柱的使用成本。
大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。但是，根据实际是分析工作，也可不必与分析色谱的 填料完全相匹配。
对于选择保护柱的原则是；在满足分析分离要求的前提条件，尽可能的选择较短的保护柱结构。尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。