仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯

【第三届原创大赛】Cleanert MAS——生物样品的前处理技术,取代传统的蛋白沉淀法

厂商论坛

  • 在药物代谢和动力学研究中,需要对血浆中的药物进行检测,但是基质中存在蛋白质、磷脂等
    杂质难以去除。传统的蛋白沉淀法虽然比较快速,但是并不能有效地去除这些杂质;而固相萃取方
    法由于操作步骤较多、效率低,不适合DMPK大批量检测样品的需要,而且存在一些水溶性很强的
    强极性药物,固相萃取并不适合应用。
    本文介绍了一种快速高通量的方法,称之为Cleanert MAS(Multi-function Impurity Adsorption SPE,多
    重机制杂质吸附萃取净化法),利用一些特殊的吸附材料配合乙腈的作用,可有效地去除磷脂、脂肪
    和部分蛋白质,最大程度上消除了杂质的影响。采用96 孔板形式,MAS法可以具备高通量地处理
    样品的能力,满足DMPK的检测要求。
    本工作选择了一种叫氨氯地平的药物来验证MAS的实际应用效果。
    1 实验部分
    1.1 主要仪器与试剂
    Shimazdu LC-20AT 高效液相色谱仪:天津博纳艾杰尔科技有限公司产品,配备紫外检测器,
    ABI4000 Q Trap 质谱检测器,12 位固相萃取装置;Venusil ASB C18 液相色谱柱(2.1 mm×
    150 mm×3 μm);MAS净化柱;Waters HLB 固相萃取柱(60 mg/3 mL)。甲醇、乙腈(色谱纯),
    甲酸、醋酸铵(分析纯),氨氯地平对照品(中国药品生物制品检定所)。
    1.2 样品处理
    1.2.1 MAS前处理法
    用2 mL乙腈活化MAS净化柱。将200 μL血浆和50 μL 200 μg/L氨氯地平
    标液涡旋混合均匀后,添加到MAS净化柱中。将2 mL 2%甲酸乙腈加入到MAS净化柱中(用移液枪
    快速将甲酸乙腈加入,利用冲击力使蛋白充分分散)。等待2 min后,开启真空泵将洗脱液抽过柱,
    收集洗脱液。最后用高纯氮气吹干洗脱液,用0.5 mL乙腈定容。经过0.22 μm尼龙针式过滤器过滤,
    得到进样液。
    1.2.2 蛋白沉淀法
    将200μL样品和50μL 200 μg/L氨氯地平标液加入5 mL离心试管,然后加入
    1 mL 1%甲酸乙腈,涡旋振荡3 min,10 000 r/min离心15 min。取上清,用高纯氮气吹干,用0.5 mL
    乙腈定容。经过0.22 μm尼龙针头式过滤器过滤,得到进样液。
    1.2.3 固相萃取法
    依次用2 mL甲醇和2 mL水活化HLB固相萃取柱。将200 μL血浆和50 μL 200 μg/L
    氨氯地平标液涡旋混合均匀后,添加到HLB固相萃取柱中。以2 mL 5%甲醇水溶液淋洗HLB固相萃取柱。
    以2 mL甲醇洗脱HLB固相萃取柱,收集洗脱液。最后用高纯氮气吹干洗脱液, 用0.5 mL乙腈定容。
    经过0.22 μm尼龙针式过滤器过滤,得到进样液。
    1.3 色谱条件
    流动相:V(10 mmol/L醋酸铵缓冲盐):V(乙腈)=40:60;流速0.2 mL/min
    ;柱温25 ℃;
    进样量5 μL;紫外检测器波长260 nm;检测器:ABI4000 Q Trap;software version:Analyst 1.5。

    2 结果与讨论
    2.1 样品处理
    MAS法不像蛋白沉淀法需要离心,操作比固相萃取法简单,因此效率高。
    2.2 测量条件
    选择ESI(+)离子化模式,分别用MRM:m/z 524/184(磷脂),MRM:m/z 409.1/238.1(氨
    氯地平)作为相应物质的特征监控离子。

    3 小结
    3.1 除蛋白质的效果
    在260nm波长下监测蛋白,结果如图1显示:MAS法除蛋白的综合效果比其他两种方法更好。
    3.2 除磷脂的效果
    MAS法、蛋白沉淀法和固相萃取法处理完的样品的磷脂残留含量分别为165 000 cps, 12 300 000
    cps,7 670 000 cps。结论:MAS法去除磷脂的效果最好。
    3.3 回收率
    MAS法、蛋白沉淀法和固相萃取法处理的氨氯地平的回收率分别是是89.2%,75.2%,56.1%。


    MAS 前处理法相比较于蛋白沉淀和固相萃取法有更好的回收率和除蛋白质、磷脂等杂质的效
    果,且操作更为简单,效率高,适合在药物代谢研究方面的应用。
    实际上Cleanert MAS 结合了蛋白沉淀法快速的特点和SPE的固相材料的吸附作用,可以为药物代谢和动
    力学研究(DMPK)的样品处理或者其他方面的生物样品提供一种快速的处理方法,它完全可以取代蛋白
    沉淀法。
    +关注 私聊
  • titi

    第1楼2010/11/29

    楼主内容是首发吗??是参加原创大赛吗?

0
0
0
    +关注 私聊
  • bill2010

    第4楼2010/11/30

    顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶

0
    +关注 私聊
  • bitwwwit

    第5楼2010/11/30

    此研究内容曾经发表过文章。

0
    +关注 私聊
  • aspoul

    第6楼2010/11/30

    楼主精神可嘉,但是有点故弄玄虚,这种除蛋白的方法,据我所知其他公司早就有了,一种方法好不好,除了效果,你是否还要说说价格成本呢?

0
    +关注 私聊
  • work037

    第7楼2010/11/30

    怎么连张图片都没有?

0
    +关注 私聊
  • abcde

    第8楼2010/11/30

    请问MAS SPE去蛋白和去磷脂是通用的吗?所谓通用即不管待测化合物的酸碱性和极性,采用你的方法会把蛋白和磷脂去掉,而待测物不损失!

    bitwwwit(bitwwwit) 发表:此研究内容曾经发表过文章。

0
    +关注 私聊
  • abcde

    第9楼2010/11/30

    好像所谓MAS SPE柱好像是C18+PSA

0
    +关注 私聊
  • bitwwwit

    第10楼2010/11/30

    我来回答一下各位提出的问题,首先我们做的MAS的产品的价格肯定是可以被接受的。在现在采用的蛋白沉淀96孔板的基础上增加不多。目前国内的DMPK样品前处理也正在起步,我们可以和大家一起来培育这个大环境。

    说到具体的机理,是在于磷脂具有两性,有乙酰胆碱的结构,是季胺碱,强碱;还有磷酸基团,属于强酸。一般的药物大都带有氨基或羧基这样的弱酸弱碱基团,可以通过调节洗脱强度来使磷脂被吸附,而药物被洗脱下来。

    至于具体的使用的材料,我们分了两种材料,一种可通过吸附胆碱去除磷脂,称之为MAS-A,适用于酸性药物;一种是通过吸附磷酸基团,称之为MAS-B,适用于碱性药物;对于两性的药物,我们推荐适用MAS-A,虽然药物的氨基等位点会被吸附,但是可以通过氨化的乙腈洗脱下来,得到一个好的回收。

    对于蛋白质,因为血样中不同蛋白的pka1和pka2范围较广,所谓众口难调,不能将所有的蛋白都吸附,但是相对于普通的蛋白沉淀还是要效果好。这个我们通过实验比较证明了。

    最后我们在填料的最下方有0.22微米的膜,可以过滤。

    总而言之会得到一个很干净的样品,相比较蛋白沉淀法而言。
    对于一些不能用SPE处理的极性物质,MAS也是一个很好的选择。
    特别的是,在一些临床前的实验室,样品量很大的时候,MAS可以比SPE更适合高通量的筛查。而这样的实验室在国内也处于一个起步的阶段。

    如果大家想尝试一下,可以和service@agela.com.cn 或者400-606-8099联系试用,我们提供装在小柱管里的试用装。
    附件是Cleanert MAS的介绍。

1
查看更多
猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐
举报帖子

执行举报

点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...