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【转帖】ZT：红外分光光度计在药物分析当中的应用

zwyu

2011/06/18

红外光谱（IR）

转一个别的论坛搞的某期“百家讲堂”活动，是关于红外的，供参考。 --zwyu

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红外分光光度计在药物分析当中的应用

主讲人：ludy

ludy从事多年的药品分析和药品质量控制工作，虽工作环境较单一，但日常勤于思考善于联想，注意总结日常工作和搜集各类相关资料，愿意与广大药物分析和研究者共同探讨一起进步。我们的口号是：一个苹果大家平分，一个好的思路大家共享。
（主办：我的仪家；协办：实验室社区、生技论坛、色谱世界、39检测认证论坛）

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红外分光光度计相信大家就算没有用过也见过，没有见过也听说过，比如进口品牌的Nicolet、岛津、PE生产的各类型红外分光光度计。红外分光光度计是用一定频率的红外线聚焦照射被分析的试样，如果分子中某个基团的振动频率与照射红外线相同就会产生共振，这个基团就吸收一定频率的红外线，把分子吸收的红外线的情况用仪器记录下来，便能得到全面反映试样成份特征的光谱，从而推测化合物的类型和结构。这仪器在药物分析、环境监测、化工领域均有广泛的使用，但迪迪学识有限，也只能对红外分光光度计在药物分析当中的应用，做一粗糙归纳，与诸君共享。

一、在标准方法上的应用。

基本上一个方法在国家标准上得以应用，就说明是一个比较成熟稳定的方法，适合全国各种实验室使用，经得起重复。咱就先说红外分光光度计在《中国药典》上的应用。
由于红外光谱特征性较强，用于物质鉴定较紫外光谱更可靠，特别是用于化学结构比较复杂的药品活化学结构相互之间差异小的药品的鉴别，那是远胜于用其他常规理化鉴别方法。《中国药典》1977年版开始应用红外光谱鉴别药品，不过早期用的是色散型红外分光光度计，然后逐渐被傅立叶变换红外分光光度计所取代了。
不要以为红外只能做鉴别，当然，目前在《中国药典》里主要是做鉴别，但也偶尔用来进行杂质检查。实际上红外也能做含测，这点我们留到下章再讲。
随着红外分光光度计的逐渐普及，《中国药典》里采用该仪器做鉴别的品种也逐年增多，而且从仅用来鉴别原料药发展到开始鉴别制剂。早期一个原料药的鉴别项目，是非常多的，有的品种甚至达到十几个鉴别项目，要通过不同的化学反应鉴别基团，还要上紫外观察最大最小吸收，甚至再弄个薄层色谱。但是有了红外分光光度计后，妥了，一个红外图谱扫描下来，是就是，不是也很清楚。据说这个思路也是跟老外学的，向USP靠拢，人家美国药典中的鉴别项目，就是用红外来确证的。《中国药典》红外光谱测定法中试样的制备方式。气体、液体和固体样品均可用红外分光光度法发进行分析。（测定气体迪迪还没见过，也是好奇的很哪），常用方法有以下4种：
1、压片法通常为KBr（溴化钾）压片，少数品种采用KCl（氯化钾）压片，样品与KBr的量的比例一般为1：100，样品用量及片子的厚度，以能得到基线80%以上透光率，最大吸收峰约在20%透光率的红外图谱为好。
2、糊法常用糊剂为石蜡油，将样品研细，与糊剂混合成糊状，夹在两窗片之间进行测试。
3、薄膜法薄膜的制备可将样品直接放在盐窗上加热，熔融后涂成薄膜，或将样品溶于挥发性溶剂中，滴于盐窗上，待溶剂挥发后即得薄膜。
4、将样品溶于适宜的溶剂，制成1%~10%浓度的溶液，置于0.1~0.5mm厚度的液体池中录制光谱。所用溶剂应具备以下条件：对溶质有较大的溶解度；溶剂在较大波长范围内无吸收；不腐蚀液体池的窗片；与溶质不发生化学反应等。常用的溶剂有二硫化碳、四氯化碳、氯仿和环己烷等。
其实在实际应用中，绝大部分都是用压片法，也就是将固体的药物研细，与溴化钾粉末混合后压片，放入样品池中扫描图谱。有一些为油状的药物，则是沾少许涂抹于压好的溴化钾片上，放入样品池中扫描图谱。
《中国药典》中的红外鉴别，多采用标准图谱对照法，即将样品测得图谱与《药品红外光谱集》里的图谱相对照，相同则为同一物质，不同则为不同物质。也有少部分样品采用与对照品图谱对照，即将样品测得图谱与对照品同法处理测得的图谱相比较，此法多见于新药标准中采用（迪迪窃想：可能是因为新药，还没有经过权威部门大量实验验证出一个成熟的标准图谱吧）。
《中国药典》最早应用红外分光光度计是用来鉴别甾体激素类药物。因为甾体激素类药物分子中大多具有α、β不饱和酮结构，他们的紫外吸收光谱非常相似，用紫外光铺法很难鉴别，其他理化鉴别方法如熔点、选广度和显色反应同样缺乏专属性，而它们的红外光谱却有明显区别。比如那个醋酸泼尼松，醋酸地塞米松，全都是“松”，你单单用紫外和理化鉴别，很难区分。
由于分离提取这些前处理技术的局限，起初红外分光光度计很少用于药物制剂的鉴别，因为鉴别制剂首先需要对样品进行前处理，要避免辅料的干扰和晶型的改变，不象鉴别原料药基本上都是拿来就用不需处理的。比如在《中国药典》迪迪就只碰到过甲睾酮片这一个制剂，是用红外鉴别的。
但是在研究领域，则有很多研究人员致力于采用红外分光光度计鉴别药物制剂，也发表了许多论文。其实只要前处理方法能重复而且不改变主料成分的性质，用红外鉴别原料和鉴别制剂的仪器操作是完全一样的。比如对主药规格较大的片剂，象甲硝唑片啦、对乙酰氨基酚片啦，采取提取分离和重结晶得到纯品，然后进行红外鉴别。这些个片剂价格便宜量又足，一片药片中主药成分往往占70%以上，真是很好提取的对象呢。迪迪稍微检索了下，发现不但片剂、胶囊剂有红外鉴别的论文，连注射剂都有了。
英国药典和美国药典早就采用红外鉴别各种不同剂型的制剂了，因此顺应形势紧跟潮流，《中国药典》2010年版也增加了若干个红外鉴别制剂的品种，当然，新版药典也增加了红外鉴别原料药的品种了。
迪迪个人估计，这个进步在某方面，也得多谢那些高科技造假者，因为他们针对标准而发明创造出各种各样的造假掺假方法，使得标准也不得不魔高一尺道高一丈，与时俱进地采用更能准确鉴别的鉴定方法，而红外分光光度计，在鉴别这方面具有不可比拟的优势啊。
红外光谱不仅可以提供化合物的类型、官能团以及结构异构等信息，还能反映出化学键的键长和键角等结构的诧异。当某些药品具有不同的晶型结构时，它们的键长和键角等就会发生不同程度的变化，从而使其红外光谱中的某些特征频率、峰形和峰强出现显著差异。因此采用红外光谱法检查药品中低效（或无效）晶型，方法鉴别又可靠。《中国药典》中甲苯咪唑中A晶型的检查，就是一例。甲苯咪唑中A晶型是无效晶型，C晶型为有效晶型，这两种晶型在不同的波数处有最大吸收。采用石蜡糊制法，分别测定供试品与含有10%A晶型的甲苯咪唑对照品的红外图谱，通过计算相应峰位的吸收度比值进行判断。
用红外分光光度计测定样品含量，目前《中国药典》还没有收载，在美国药典(USP)中有收载，可惜迪迪功力不够，没能看到是怎么个含测法，望有识之士加以补充啊。迪迪查到有论文采用衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）法测定含量的，也有直接测定光谱，处理后进行含测的。

二、在药物研究中的应用。

这里讲的红外分光光度计的应用，即是在研究领域上的，这些方法也许目前还未得到普及和推广，但已逐步显示出它们的实用价值。
比如有研究者运用Matlab小波变换的处理技术对红外光谱进行滤噪与平滑，获得光滑的谱图，建立了红外光谱对药物含水量非线性定量模型。这是用红外来测定含水量的，请注意，不是近红外测水分哦，是红外测水分。不过迪迪对此有点点怀疑，这个这个样品在压片过程中，尤其是在红外灯照射下，自身的水分会不会有所减少啊？
也有研究者用红外进行样品纯度的检测，通过比较不同纯度的样品建立一些数学模型，从而达到测量样品纯度的目的。
还有研究者用红外测定中药制剂掺杂化学成分，利用红外光谱矢量的特征，不经化学提取分离，直接进行中药掺假判别。它利用已知化学药物的红外光谱和待测样品的红外光谱，通过计算机分析给出特征值，直接得到样品中化学药物的含量。如用此方法测定壮阳类药物中参入西地那非。
最后，也是应用最广泛的药物研究领域，就是红外分光光度计在中药材真伪鉴别上了，这方面的研究和实用价值颇大，比如用红外鉴别药材产地啊，药材的真伪，药材的不同采摘期啊。有相当多的研究，都是采用先提取中药中的某成分，或者采用某种提取方法提取出某混合物，然后进行红外鉴别。
铛铛铛铛铛，让我们鼓掌欢迎迪迪最崇拜的孙素琴孙老师的研究成果出场。以下为新闻简介：孙素琴突破现有分离提取思路，创新采用红外指纹图谱直接、快速、无损测定中药材、中药配方颗粒、中药注射剂，中药保健品等，并借助模式识别技术识别不同产地、生长期、野生与栽培的药材，不同炮制法、不同批次的中成药、保健饮品。她提出了红外光谱的“三级鉴定”法。它利用了一维红外光谱、二阶导数谱和二维相关红外光谱。差异性较大的不同种药材仅需要一般的红外图谱就能够简单地做出判定，我们称其为一级鉴定。当药品的差异性较小，用普通的一维红外图谱显示不出它们的差异性，我们可以采用导数光谱对其进行特征提取，在中药分析中常用的导数光谱为二阶导数谱，这是因为在二阶导数谱中半峰宽只有原谱的1/3左右，大大提高了谱图的分辨率。采用红外光谱图和二阶导数谱图相结合，称其为二级鉴定。至于四阶导数谱的半峰宽更窄，谱图的分辨率更高于二阶导数谱，但它对原谱的质量要求更高，且噪音的影响较大，所以通常不便使用。在当红外光谱和二阶导数图谱差异性较小而不足以作判断时，则可凭借二维相关红外光谱加以判定，称为三级鉴定。目前我们暂且选用了热微扰来得到药材的二维相关谱。
根据咱的细心揣测和认真思考，大胆总结了孙老师的做法就是：直接取样品打成细粉，压片测得红外图谱，通过一系列软件和计算方法的处理，根据建立道地药材的标准图谱库来判断样品的种属、产地等信息。又根据小道消息：孙老师本来不是搞中药的，所以干脆不管什么君臣佐使，直接把药材拿来研细压片扫描，而且借助清华大学强大的软件设计能力，通过后期软件处理使扫描得的图谱显示更多特征信息。
目前中成药研究开发价值很大，从而对中成药的质量研究也愈加深入，迪迪相信红外分光光度计在这方面，是有其独到的作用的。坦率地说，迪迪个人认为，红外嘛，这个样品前处理不难，制样也不难，测定也不难，难就难在对图谱的分析和再处理上。

谢谢大家欣赏，因为匆匆而就，错漏不少，谨抛砖引玉，供大家思考参考哈。

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部分精彩回帖：

其实我个人理解来说，红外在原料药分析上，起着重要作用。但是在中药，且是中药成分分析工作上，才是刚起步呢。虽然上文介绍了很多人的研究，但我个人觉得他们将红外应用在中药成分分析上都有个局限性，就是无法在全国推广。只能在某企业某部门内部流行下而已。--ludy
我能说的就是，红外比质谱便宜，而且操作起来成本也低啊，不需要耗费太多试剂和耗材的。--ludy
红外测油仪实质就是根据特殊情况的需要，限定了波长范围的红外光谱仪。--ludy
作为基质的溴化钾，200毫克，作为待测成分的试样，几毫克即可。--ludy
做空气扣除的主要目的应该是为了去除水、二氧化碳以及仪器对测试结果的影响。--ludy

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ghcily

第1楼2011/06/19

学习一下其他论坛高手的帖子。

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happyalife

第2楼2011/06/24

只要国家制订相应的标准，红外在中药方面也能推广起来

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salmon

第3楼2011/07/14

nod，虽然中药比较复杂，但是红外也不是吃素的，关键看怎么用了。应该有很好的前景。

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yangminxing

第4楼2011/09/04

孙素琴主编的关于二维相关红外谱在中药材鉴别方面的应用，该技术很有前途

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