仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
1
收藏
点赞
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
生命科学仪器
>
生命科学仪器综合讨论
>
帖子详情
引用 在发酵工艺角度看蛋白表达
省部重点实验室
2011/08/01
私聊
生命科学仪器综合讨论
本文引用自发酵《在发酵工艺角度看蛋白表达》
引用
发酵 的 在发酵工艺角度看蛋白表达
在分子生物学角度讲,找到或合成外源蛋白基因,构建质粒,并导入细胞以表达具有生物活性的折叠正确的蛋白,是一种成熟的常规技术。目前,包括酶,抗原,抗体,激素,其他小分子调节蛋白在内的很多蛋白,都已经用这种技术实现了工业化生产。在具体的工艺选择上,历史沿袭习惯和表达体系的选择,对工艺稳定性,成本,有巨大的影响。
目前,常用的蛋白表达系,有3个类别:
1,大肠杆菌表达系。
大肠杆菌的遗传背景十分清楚,代谢相对简单,发酵副产物少,在不是很严格的情况下,是表达蛋白的首选。通过按经验选择合适的菌株及合适的质粒,既可以以包涵体的形式得到大量的目标蛋白,又可以在细胞外得到可溶性蛋白,是常见的一种表达系。
2,酵母菌表达系。
用酵母做表达系,理由之一,也是遗传背景清楚,而且,当蛋白分子量过小,不能形成包涵体时,或蛋白的二硫键过多,不易体外复性时,酵母菌就成了合适的选择。另外,酵母对蛋白也会有一个简单的修饰,近似于高等动物的蛋白糖基化过程。这样,在合成在体液中发挥作用的蛋白,而且,又不能(技术水平限制)用动物细胞时,就可以退而求其次的选用酵母菌表达。一般是用信号肽把蛋白导出细胞,在发酵液中以可溶性蛋白的形式存在。这也是一个常见的表达系。
3,动物(或说,人的)细胞表达系。
这种情况,在纯度或毒性方面有较高要求的产品应用。一般国外产品应用较多,国内还没有用动物细胞表达蛋白实现商业化生产的报道。由于技术限制,国内工业化生产用这个方法目前还有较大难度。
这3种表达系,各自有自己的优缺点。首先,在潜在的毒性影像方面讲,由于和真核生物亲缘关系太远,大肠杆菌就最不合适。其次是酵母菌。而在表达量和代谢控制成本上来讲,酵母菌和动物细胞又是差强人意的。现在,很多蛋白习惯性的选用酵母菌做表达系,就是因为早期提取蛋白技术低下,而动物细胞培养技术又不过关的原因所致。目前,虽然提取工艺提高了,但作为蛋白这种高附加值产品,运作成本集中在销售而不是生产,所以,降低生产成本的诉求很低。站在降低开发难度的角度讲,一方面,质粒构建和质粒与菌株的匹配方面依赖大量经验,另一方面,发酵工艺策略选择与发酵工艺优化又需要很大的投入,所以,技术开发部门沿用自己熟悉的,已经积累了大量经验的表达系,是合理的。
不过,随着分子技术进一步的发展,分子技术进入低附加值的产品领域又是必然的,降低生产成本就变的越来越必要了。
大肠杆菌表达系有两种得到外源蛋白的方法:
1,缓慢的表达,得到可溶性蛋白,这种方法产量和酵母菌表达类似,与酵母菌比,不具有明显的优势,一般是有做大肠杆菌传统的研究机构生产小分子蛋白的一种沿袭性做法。
2,使用T7启动子表达蛋白,这样,高速的蛋白表达速率使蛋白来不及折叠,在细胞内形成非水溶性的包涵体。最后目标蛋白可以达到总细胞质量的15%-25%,这样,就为降低成本提供了一种可能。
不过,在使用T7启动子表达时,也存在两个难点:
1,蛋白的复性技术,如果形成可溶性蛋白,那利用(使用分子技术加载在目标蛋白上)信号肽,只要过一遍柱子就能分离得到纯度非常高的,具有生物活性的产品,而形成包涵体,对提取,复性就有较高的要求,特别是二硫键的存在,会对复性产生很大的影响。在目前国内和国际流行技术看,并不是所有的蛋白都能在预定成本下复性的。
2,任何情况下,高产都是代谢网络互相依赖与作用的结果。在如此高的表达量下,甚至细胞的形态都已经发生很大变化,正常代谢受到严重干扰,以至于放大时,摇瓶工艺对发酵工艺几乎没有任何参考价值。发酵工艺策略的选择将直接依赖于工程人员在生化,生理水平对菌株的理解,而匮乏可资参考的数据资料。发酵工艺的优化要离开摇瓶经验在发酵罐上逐步进行,这样,整个发酵工艺的确立就需要比想象中要大得多的人员与时间的投入。
另外,再说一下糖基化的问题。
在动物细胞内合成的折叠正确的蛋白,在分泌入体液前会有一个糖基化的过程,加上一个糖链就不会很快被蛋白酶当做折叠错误的蛋白水解掉。但是以微生物为表达系表达的蛋白,不具有动物细胞的修饰过程,用大肠杆菌表达的目标蛋白,很快会在血液中被降解。解决或回避这个问题,有两种方法:
1,用动物细胞表达,一般,是用癌化的人类细胞。由于动物细胞培养技术要求过高,在国外比较昂贵的医药中有应用,国内不常见。
2,由于酵母菌也有一个对蛋白的粗略的修饰过程,可以用酵母菌表达目标蛋白。这个技术,国内国外都在用,可以是一个权宜之计。主要难点集中在对合适菌株的分子水平的改造,以达到尽可能接近满意的修饰效果。
这样,就可以在不同目标蛋白上表达系和发酵工艺上做出选择。如果是小分子,无糖基化修饰或不在体液中发挥作用的蛋白,可以选择大肠杆菌和酵母菌表达系,得到可溶性蛋白,然后提取。如果分子量合适,并对生产成本有诉求,而且可以比较方便的复性,则选用大肠杆菌表达系,得到包涵体,然后复性。如果是需要在体液中发挥活性并有糖基化要求的 蛋白,则选用经过分子生物学改造的酵母菌表达系。
当然,并不是任何一个实验室都同时拥有或擅长所有的方向的。而难点,往往集中在以下3个方面:
1,大肠杆菌蛋白包涵体复性。
2,糖基化修饰。
3,发酵工艺(工程菌株的工业水平)的确定。
做工程一般是理科实验室的弱项,而工科实验室做基础又很少,在把工科和理科结合方面,我们实验室还是有经验和成功先例的。
下面,以溶菌酶为例,阐述一下蛋白表达系的选择和工艺的确定。
溶菌酶是一类具有种属差异的非特异性免疫物质,在动物界中普遍存在,种类繁多,其实,在植物和微生物中也有发现。但研究最多的还是动物。开发兽用溶菌酶,主要是想作为抗生素的替代物,作为添加剂使用。因此是一个低附加值的产品。下面一切的工作,都会围绕“兽用”和“低附加值”展开。
首先,比较几种常见和认为有效的溶菌酶,杀菌效果最好的是人的溶菌酶,但考虑到潜在的危险(具有对人溶菌酶产生抗性,并使抗性基因扩散),舍尔求其次,用了鸟类蛋清溶菌酶,作为表达对象。
然后,在得到溶菌酶蛋白的一级结构后,对此进行了分析。此蛋白不会用于体液内,故没有糖链修饰的问题。分子量不是很大,但也不太小,130左右的氨基酸构成,足以形成包涵体,这就为用大肠杆菌表达系高效表达提供了可能。讨厌的是有4个二硫键,其中有两个在结构复杂区域,折叠正确有一定的困难。但是,如果用酵母菌做,可能没法解决成本问题,即便优化工艺现在过去了,也不会是最终版本----肯定会有人用大肠杆菌做。所以,结论就是必须知难而进,拿下复性工艺。
另外,由于是低附加值产品,发酵吨位就不能太小。以往分子生物学流行的50升,100升小罐发酵,肯定是不行的。发酵罐的放大,除了溶氧,剪切力发生变化,更重要的是搅拌线速度改变了胞外酶以及包括细胞本身的代谢方式和速度。在胞内体现就是氧化还原电势的改变,这在工艺上会带来很多麻烦。虽然说,一般是放大后产量往往提高,但放大过程中,小罐的经验就不能照搬了。同时,也因为是低附加值产品,发酵过程中诸如质粒丢失等稳定性要求,就很高了,应为只有稳定,才能控制成本。这样,工艺就成了第二个难点。
明白这些之后,按照大肠杆菌的喜好,合成了溶菌酶的基因。然后构建质粒,导入细胞。在摇瓶水平表达溶菌酶。在筛选复性条件的同时,就同时在发酵罐水平对工艺稳定性进行了优化。
首先,为了进一步提高质粒稳定性,对初始培养基进行了重新设计。并改动发酵工艺策略,由于是胞内产物,我们应用高细胞密度发酵控制法延长限制性生长时间(不能用经典发酵的延长对数期生长时间的办法,对工程菌不适合,会造成质粒丢失,代谢紊乱等一系列问题),提高细胞量,并改变了诱导时机,得到了稳定的高产,具体数据比较枯燥,就不在此展开了。
提取方面,经过不懈的努力,我们也掌握了比较成功的复性条件(具体由另外人员负责,也不做详细介绍了)。这样,工艺才基本拼凑好。进一步优化,在试生产多次重复时在进行。
以上,是外源蛋白表达的粗略的技术和工艺的过程。
分
该帖子已被
版主-zhang8826857
加3积分,加2经验;加分理由:感谢分享^_^
相关话题
1
Biotechnol. Biofuels:葡萄糖和木糖同步利用可生产油脂
2
【有趣】Alcheringa:科学家发现远古极地恐龙足迹
3
【仪器使用】酶标仪的原理及使用方法
4
【研一时老师布置的作业,自己总结的】在线质谱仪的构造及其在发酵过程中的应用
5
【非常有趣】Hum. Reprod.:做爸爸死于心脏病可能性较低
+关注
私聊
dong3626
第1楼
2011/08/04
应助达人
不是很清楚?
现在这种蛋白质表达,在工业化阶段发展到 怎么样了
?
0
发表回复
近期热榜
赛默飞实验室产品焕新计划有奖调研!
【七月征文】不一YOUNG实验“猿”
报名开启:ICS2024第十三届光谱网络会议!
推荐收藏!盘点中药材及饮片检测解决方案
热门活动
甄选国优仪器,助推设备更新
采购咨询618活动:1000元奖励等你拿
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
更多推荐
【分享】PNAS:发现储存“时间记忆”的脑部细胞
2009/10/28
纪念微生物学之父巴斯德诞生190周年
分享
2012/09/02
天下还有多少“毒胶囊”?
讨论
2012/08/07
2012年医疗器械发展前景
分享
2012/02/29
你认为哪个学历的员工在企业有更好的发展?
讨论
2012/02/25
【每日一题8】【有奖问答】天天有积分哦^_^
讨论
2011/12/27
什么是fab抗体片段?scFv与Fab抗体的区别
资料
2023/08/21
【原创】写给同志们
2006/12/19
【我们不一YOUNG】蛋白质浓度测定方法大全
原创
2024/07/06
【我们不一YOUNG】HTS酶抑制剂筛选的流程介绍
分享
2024/07/05
太空微重力环境下癌症药物研究系统进口航空航天随机定位微重力模拟仪AJ001X
分享
2024/07/05
弱光成像或体内发光实验Atik TE科研制冷CCD相机
原创
2024/07/05
【我们不一YOUNG】结缘仪器,一起结缘,与仪器信息网一起成长
原创
2024/07/01
心血管检测仪打开后出现ch375dll.dll电脑丢失怎么办
已应助
2024/07/01
出售贝克曼DXC800生化分析系统
原创
2024/06/21
编织袋拉力机
原创
2024/06/14
检测报告一定要有判定结果吗?
求助
2024/07/01
气相FID重现性不好原因
求助
2024/07/01
求助,非甲烷总烃测定中,除烃空气0.4mg/m3,怎么计算的呢?是按总烃计算公式吗?
已应助
2024/06/29
求助安捷伦GC7890B,EPC无响应解决办法
求助
2024/07/01
HJ1332便携非甲实际应用问题
讨论
2024/07/01
衍射斑点标定求助
已应助
2024/06/30
EI源的灯丝镉厂家通用吗?
求助
2024/07/03
‘有奖问答’对错题’:某仪器零件的长度X和质量Y的相关系数为0.68,改进后长度缩短0.2厘米,质量低0.5克,新零件的长度和质量的相关系数为( )
讨论
2024/07/02
分析纯试剂重蒸馏后是否可用优级纯替代?
求助
2011/08/01
工业微生物菌种筛选方法
资料
2011/08/01
仪表保温箱对仪表的保护和保温
资料
2011/08/01
请问哪里能买到XRD用纯铁粉标样
求助
2011/08/01
固态发酵的分类知识
分享
2011/08/01
做过洗衣液,再做洗衣粉
原创
2011/08/01
分子生物学对现代发酵影响
分享
2011/08/01
光电传感器介绍
资料
2011/08/01
品牌合作伙伴
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...