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【经典精读】一篇小鼠造血干细胞研究方法综述的精读笔记
省部重点实验室
2011/09/07
私聊
论文写作和投稿
原文是Purton, L.E., and Scadden, D.T. (2007). Limiting Factors in Murine Hematopoietic Stem Cell Assays. Cell Stem Cell 1, 263-270.
发表在2007年cell stem cell 杂志上,最近由于要进行相应的课题研究,拿来精读了一番,做了一个笔记,发上来和大家分享,由于初涉小鼠造血干细胞这个领域,肯定有很多地方理解不全和错误,请大家指正。
下面是我的精读笔记:
小鼠造血干细胞研究方法综述
一.关于HSC 免疫表型
1. Thy1.1lo,Lin-Sca-1+Cells:其缺点是Thy1.1只表达于C57BL/Ka-Thy1.1小鼠,不表达于常用的C57BL/6小鼠;
2. Lin- c-Kit+ Sca-1+ Cells(LSK):异质性,含有祖细胞,HSC含量不超过10%;结合CD34和Flt3可以分为long-term repopulating HSCs (LKS+ CD34- Flt3-) ,short-term repopulating HSCs (LKS+ CD34+ Flt3-) ,以及multipotent progenitors(LKS+ CD34+ Flt3+);
3.荧光染料标记HSC: Rhodamine 123, Hoescht 33342, 以及Side Population,Rhodamine 123为线粒体染料,Hoescht 33342为DNA染料,HSC能够更多地将这两种染料泵出细胞外,所以染色较浅;
4. SLAM Family Members:SLAM antigens (CD150+ CD244-CD48- cells),其优点是不像Thy1.1和Sca-1其表达受到品系和发育阶段等的影响,在更多的种系的小鼠中适用
二.克隆形成实验
:主要反映的是祖细胞的造血能力,不反映HSC,检测T系和B系需要另外特定的培养条件;
三.Cobblestone Area-Forming Cells/Long-Term Culture-Initiating Cells,鹅卵石样区域形成细胞实验/长期培养-启动细胞实验:
体外检测更早期造血干/祖细胞的方法,但由于feeder layers和培养条件不同,实验结果在不同实验室间稳定性较差,对于其是否真正能检测造血干细胞也比较有争议,不过在一些情况下,比如归巢(homing)或植入(engraftment)有缺陷导致体内造血重建实验无法进行时,这两个方法是较好的替代方法;
四.Colony-forming unit-spleen (CFU-S)脾集落单位形成实验
:属于短期(1-3周)体内重建实验,检测的干祖细胞比体外CFC早,但比HSC晚;
五.long-term repopulating assays,长期重建实验,包括:
1. competitive repopulation assay:竞争重建实验:属于定性或者半定量研究HSC重建能力的方法,不能区别是HSC的数量还是质量造成的结果差异,得到的结果为RU即重建单位;
2. limiting dilution assay:统计的指标是造血重建失败的小鼠数目,采用泊松分布来计算HSC的频率,得到的结果为CRU即竞争重建单位;Stem Cell公司的免费软件L-Calc,可用于分析实验结果。limiting dilution assay有两种方法:
1CRU assay,采用最小数的HSC作为竞争细胞,可以在单细胞水平检测HSC;
2也称为CRU assay,采用标准的,足量的HSC作为竞争细胞,不能在单细胞水平检测HSC;
3serial transplant assay,多代移植,最为严格的检测造血干细胞的方法;
六:Limiting Dilution Assays需要考虑的几个重要因素:
1.竞争细胞:
1compromised bone marrow,即连续两代重建成功的骨髓细胞,比较耗时
2W41/W41受体小鼠:c-kit基因发生突变,具有更加敏感的宿主微环境,能够检测更少的植入的HSC,不需要另外的HSC作为支持细胞(竞争细胞);
3全骨髓细胞(whole bone marrow cells):经验表明2 X10
5
competing bone marrow cells比较适合
2.受测细胞(Test Cells, Unknown HSC Potential):有人用LKS+ CD34- cells,但作者认为全骨髓细胞最好,原因是这种方法是在功能上评价HSC,避免了HSC在基因修饰的小鼠中免疫表型发生变化导致的结果的不可靠,在作者实验室通常采用的受测全骨髓细胞数为8 X 10
3
到2 X10
6
;
3.重建失败的标准:现在一般认为受测细胞的重建比例小于1%为重建失败;在重建比例中,红细胞是不计算在内的,因为其不表达CD45,但一般认为只要其他系重建成功,红系应该也会重建成功;
4.分析重建的时间点:看长期造血重建,最少要16周,最佳是六个月;
5.其他考虑因素:归巢,HSC各系分化阻滞或减弱,祖细胞增殖动力学特性的改变,造血微环境对HSC的影响等等
七.区分供体,受体的遗传学标志:
最常用的是CD45.1,CD45.2系统,还有可以通过性别(Y染色体)来区分。
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