ZT：移液器的使用、维护和校准

移液器的使用（二）重点注意事项

在网上所能看到的移液器使用方面的文章，基本都是按照操作的顺序粗略讲述一些操作规范。这当然无可厚非，但不同的操作细节对移液精度的影响不同，如果全部照做，必然会影响操作的效率。所以，我这里把相关的一些使用规则按照其重要性进行分类：“重点注意事项”是一定要遵守的，但如果对精度要求不高，就不必遵守“其它注意事项”而按照效率优先的原则来操作。这两类注意事项则分别按照操作的顺序排列。下面是重点注意事项：

1． 装吸头

在移液器的套柄最下端进入吸头后，如果在吸头盒内操作，在轻轻向下压的同时左右晃动移液器或稍稍转动移液器（仅单道移液器可旋转）1－2秒即可；如果是用散装吸头，在用手把吸头往移液器方向轻轻施压的同时稍稍转动吸头1－2秒即可。如果这种操作不能达到理想的密封性，就需要检查吸头和移液器了（以后会详述）。

2． 量程选择

一般说来，移液器的可用量程范围是移液器最大量程的10-100％。对特定的一支移液器，其移液的精度随移液量的降低而降低。以市场上用的较普遍的EPPENDORF的RESEARCH移液器为例，其量程范围为20-200ul的移液器，在移取200ul纯水时准确度为±0.6％，在移取100ul纯水时准确度为±1.0％，在移取20ul纯水时准确度为±2.5％（这些数据引用自EPPENDORF的产品宣传手册）。因此，笔者推荐最佳的量程范围是移液器最大量程的35-100％。

3． 吸液的深度和角度

（1） 吸头浸入的深度：有下面一个表格供参考（当然，不同容器需要的深度也略有不同，所以无需死记这个表格，只需把握两个原则：其一，吸液的深度需保证达到所需的移液量；其二，让吸头外壁尽量少的接触液体）。



（2） 移液的角度：在移液的过程中须一直保持移液器在竖直状态，最大倾角不超过20?。

4． 吸液的速度

在吸液过程中，须慢慢降低拇指的下压力，使液体在吸头内均匀且缓慢的上升。

5． 停留时间

对于大量程移液（ml级）和粘度明显高于水样品的移液，在吸液时松开拇指后，须使吸头在液体内停留3－5秒后才能移出（因为液体进入吸头的运动相对比较费时，必须保证液体达致动态平衡）。

6． 存放

在移液器使用完毕后，须将移液器调至最大量程，然后挂起（可以挂在专用支架上，也可以挂在实验台柜的金属横杆上）。

移液器的使用（三）其它注意事项

如果您只是粗略的移液，本文的内容您完全可以跳过；如果您追求高精度的移液，我建议您还是花点时间看看下面的内容。

1． 量程调节

在调节量程的过程中，遵守“从大到小”的原则。具体来说，当把大量程调为小量程（如从200ul调到100ul）时，直接调节到位即可；当把小量程调为大量程时，需先超过所需量程1/3到1/2圈，然后再回调到所需的量程。这样做是为了消除移液器本身的机械误差。

2． 润洗

所谓润洗，是在正式移液前，先用吸头吸取待转移的液体，然后再把它作为废液排掉。润洗吸头的目的是减少吸头内壁吸附力对精度的影响，润洗次数以2次为宜。

3． 停留时间

对于物理性质非常接近水的液体（我们在这里及以后的文章中都简称水溶液），在吸液过程中松开拇指后，须使吸头在水溶液中提留1秒放开移出。

4． 排液

排液的方式主要有三种：（1）吸头贴容器的内壁排液，这是最常用和最经典的排液方式；（2）直接在液体上方排液，这种方法简单而不容易受客观因素限制；（3）将吸头插入液面下排液，这主要用于小量程移液器或特殊液体的排液，只是注意一定要在吸头从液体中移出后放开松开拇指。这三种排液方式均可，只是在考察重复性时要始终用同一种排液方式。

5． 手温

虽然移液器的握持部分的外壳一般都是由低导热材料制成的，但连续握持时间长了，手的温度还是会被传导到移液器内，里面的部件有可能会因温度变化而发生形变，从而影响移液精度。因此，在操作过程中需注意：其一，在操作过程中，只要不需要拇指用力，就尽量靠指钩把移液器挂在手上而松开手掌；其二，一般连续移液不要超过半小时，如果工作量繁重，可换手操作。这样，在尽量减少手温影响的同时也让您宝贵的手得到一定的休息。

移液器的使用（四）特殊样品的移液技巧

多数情况下，移液器的工作对象都是水溶液，但也难免会碰到一些特殊的样品，如高挥发性的样品、高粘度的样品、高密度的样品和非常温的样品等。如果您需要经常转移这些特殊的样品，我还是建议您购买外置活塞原理的移液器，虽然耗材成本有点高，但毕竟移液精度有保障；如果您只是偶尔转移特殊样品，并且财力有限，那还是看看本文，会对您尽量的提高精度有帮助（也只能说是有帮助，毕竟比专门的外置活塞式移液器差点）。

1． 挥发性样品

应当注意两点：其一，在移液前务必润洗两次；其二，在吸液完成后尽快排液。

2． 高粘度样品

采用反向移液的模式：在吸液时把吸/排液按钮按到第二档（第二停止点），而在排液时把按钮按到第一档（第一停止点）。另外，在吸液和排液时均需要3-5秒的停留时间。

3． 高密度/低密度样品

移液器的精度数值都是基于转移纯水，如果样品的密度与水的密度相差很大，则精度也会相应的很差。因此，在移液前需要先搞清楚样品的密度，然后把量程调节成待转移体积与密度的乘积。举例而言，如果一个样品的密度是1.2g/cm3，您需要转移300ul，那您应该把量程设置为360ul。这只是粗略的调整方法，严格起来还需要量器或天平作为辅助工具而进行准确的计算。总之，这基本上是一个需要经验的活。

4． 高温/低温样品

注意三点：其一，在移液前绝不可润洗吸头；其二，每次移液都换一个吸头；其三，吸液和排液都应尽快完成。

移液器的维护

移液器的维护和移液器的操作都很重要，但很少有人会对移液器进行定期的维护——没办法，移液器看起来太简单了！只是移液器并不像看起来那样简单，并且越是高端的移液器，越需要定期的维护。

一．外部清洁

移液器的外部清洁比较简单，主要还是一个“面子工程”——我想每个人都不希望自己手里握的的移液器脏兮兮的——所以，我建议使用者还是经常清洁一下移液器的外表面。当然，由于移液器的外壳都有一定的抗腐蚀性，所以常见的有机溶剂（如乙醇）和清洁剂（如洗洁精）都可以使用。但一定要注意两点：其一，务必用纸或布蘸取有机溶剂或清洁剂（后面全部统称为清洁剂）来擦拭，绝不可以直接用清洁剂直接擦拭，以防清洁剂通过移液器上的缝隙进入移液器的内部；其二，在用清洁剂擦拭完毕后，再用纸或布蘸水去除清洁剂的残留。

二．内部清洁与维护

相对于外部清洁，内部的清洁和维护就复杂多了。所以，还是建议由专人来做这个事情，如果供应商能够免费提供这个服务当然更好。一般说来，内部的清洁和维护分为两种情况：一是定期的清洁和维护，一般一年一到两次（这种清洁和维护可以要求供应商上门来做）；二是紧急情况下的清洁和维护，是由于操作不慎造成液体冲入移液器内部后或有洁净物堵塞（堵塞的表现是无法吸液）套柄后马上要做的事情。当然，这里必须提到一点：多道移液器的内部清洁和维护最好由供应商来完成。

这两种情况的步骤基本相同：

第一步，拆卸吸头推出器。不同品牌的移液器拆卸吸头推出器的方法有所不同，主要有以下几种：其一，直接用力拔下来，如EPPENDORF和GILSON等；其二，用专用工具（供应商在包装内应有提供），如Finnpipette、BIOHIT（P-line）和大龙等；其三，需要一定的技巧，但很省力（供应商有告知的义务），如RAININ和SOCREX；其四，要先拧下固定螺丝，如立洋（NICHIRYO）；其五，吸头推出器和套柄是体的，按套柄的拆卸办法，如BRAND；其六，直接拧下来，如BIOHIT（m-line）。

第二步，拆卸套柄。这个比较简单，一般都是逆时针方向拧下来（EPPENDORF等品牌的套柄不容易拧下来，可以借助其提供的辅助工具）。

第三步，取出活塞（EPPENDORF取活塞的方法比较复杂，可以参见其操作手册或咨询供应商）后清洁活塞。其方法与外部清洁相同，但要注意：其一，清洁剂应用酒精或中性清洁剂；其二，用的纸或布要质地柔软且不会掉屑。另外还有两点一定要留意：其一，大多数移液器的活塞上都有密封圈和O形环，这些配件都很小，在清洁时一般不需要取下，如果取下千万不要丢掉了，并且在装的时候要注意安装的顺序；其二，如果发现活塞已经生锈（金属活塞）或有划伤（玻璃活塞或陶瓷活塞），请就此打住，重新装好后交供应商处理。

第四步，清洁套柄内部。可以用水冲洗，但需要用电吹风吹干并自然冷却。如果堵塞了，可以用细长金属工具疏通，但注意不要划伤套柄内表面。

第五步，维护活塞。在清洁完毕且表面干燥后，在活塞表面均匀涂抹润滑剂：有的品牌（如EPPENDORF）在包装盒内会提供一小支润滑剂，如果没有，建议用硅脂，但不要用凡士林。虽然有的品牌（如RAININ）在手册上说不需要涂抹润滑剂，但涂抹润滑剂还是有益无害的。另外有一个建议，密封圈和O形环最好一年换一次（在定期维护时完成）。

第六步，把活塞放入套柄中后装上套柄和吸头推出器——虽然一般破坏比建设容易，但我想一般能拆就能装吧。当然还有一个建议，在没有异常损坏的情况下，套柄一到两年换一次，以保证移液器的密封性。

移液器的校准（一）

在移液器的校准方面，相关的规范有ISO8655和“中华人民共和国国家计量检定规程JJG 646-2006”。相比较而言，ISO8655的要求更高些。当然，无论哪个标准，都是通过称重的办法来校准移液器。在这里，我就参照这两个标准，结合自己那点可怜的经验，对移液器的校准进行详细的描述。

1． 环境

(1) 温度：控制点设在20-25℃范围内，温度变化不能超过±1℃

(2) 相对湿度：45-75％

(3) 出风口：不能正对天平，不可有强风（减少空气对流）

(4) 照明：采用冷光源，不可有日光直接照射（避免温度变化过大）

(5) 门窗：不可有窗，应有不可同时开启的双门设计（减少空气对流）

(6) 楼层：移液器校准实验室应设在一楼

2． 天平

天平应已通过校准，并放置在专门的天平台上。更重要的是，校准不同量程的移液器需要不同的天平：



为减少水蒸发对校准结果的影响，在使用可读性为0.001mg的天平时，必须同时使用天平供应商专配的移液器校准组件；在使用可读性为0.01mg的天平时，可用专配的移液器校准组件或带盖的细口容器；在使用可读性为0.1mg的天平时，用细口容器即可。

3． 纯水

二次蒸馏水或去离子水（最好是专门的纯水机生产的纯水），放在封闭的细口容器中。

4． 吸头

用移液器供应商提供或推荐的吸头（这时候可不能图便宜啊！）。

5． 自校与上门校准

这里需要简单的聊聊两个题外话：一个是“自校功能”。有的品牌，如EPPENDORF和BRAND，其移液器有使用者自行校准的功能——这是一个看起来很美的功能！但建议使用者不妨对照上面的内容看看自己是否具备校准的条件。如果具备了，那恭喜您，您可以自己辛苦了！如果不具备，还是交给有条件的公司来做吧——当然，如果您对精度的要求只是“大概齐”、“差不多”，那您也不妨自己来做校准。

另一个是“上门校准”，很多供应商（厂商或代理商）为了体现自己对用户的“关怀”，会提供定期的上门校准服务——精神可嘉，但基本上在向用户坦白：“我不是专业人士，您就多担待我的校准水平吧！”对照上面的内容，再看看客户的天平（或供应商随身携带的天平）和客户现场的环境，您也许就不会笑我太夸张了——毕竟是供应商，对校准的要求绝不可以是“大概齐”和“差不多”！

所以，校准是一个专业性比较强的苦差（等您把校准的步骤和计算看完了，您还觉得校准好玩，那我就只能吐血了），最好还是留给专业人士来做——何况说即使是专业人士和专业公司，其校准的条件和水平有时候也只能是差强人意——不信的话您可以看看供应商提供给您的小量程移液器（2ul和10ul）的校准报告，搞清楚其所用的天平的可读性就明白了！

移液器的校准（二）步骤

移液器的校准过程很多和正常操作类似，只是在细节上要求更高。因此，在步骤的介绍方面，我会重点着墨于高要求的细节。

1． 准备

纯水需要在校准前至少24小时即放入校准实验室，而待校准的移液器以及配套的吸头需要在校准前至少4小时放入校准实验室，以确保纯水、移液器和吸头的温度与实验室的一致。另外还需要确认天平是经过校准且准确的。

测试前还需要检查移液器的外观（枪体、套柄和退吸头器等）是否有异常、量程调节是否顺畅、套柄前端是否堵塞、吸液时按钮分档是否清晰以及移液器的气密性（具体测试方法我在以后的博文中会详述）是否符合要求。如发现有异常情况，需跳过测试步骤而直接进入维护环节。

2． 测蒸发率

水的蒸发对校准的结果会有或多或少的影响。如果您要校准小量程的移液器（2ul和10ul），用的是可读性为0.001mg的天平，您在正式校准前就必须测水的蒸发率（一般为0.010-0.025mg，如果您想偷懒，建议您可以直接取0.015mg）。其它情况下可以不测蒸发率。而至于测蒸发率的步骤，因其很少被用到，这里就不赘述了。

3． 测试

严格按照操作的步骤进行测试，尤其需要注意以下几点：

（1） 按从大到小的原则调整量程；

（2） 吸液前润洗吸头两次；

（3） 确保吸液的深度和角度合乎要求；

（4） 每次测试的节奏和用力尽量保持一致；

（5） 一般用吸头贴容器内壁的方式排液。

4． 计算

按照国标，移液器的校准采用“三点测试（最大量程的100％，50％和10％），每点六次”的规则，而供应商通常会选择两种规则：一是简易校准，也就是两点测试（最大量程的100％和10％），每点四次；二是严格校准，也就是三点测试（最大量程的100％，50％和10％），每点十次。使用者根据自己的实际需求选择一种规则完成测试后即进入计算环节。

在国标和很多参考书上都有准确性和重复性的计算公式，在网上也有相关的一些免费小软件（供应商的校准软件更好些）。我在这里就不罗嗦了，但还是要提醒两点：

（1）10ul及以下量程的测试结果需加上蒸发率才可以作为称重的最后结果；

（2）需把称重的结果换算为体积方可进行计算。在一个大气压的前提下，综合考虑温度和密度的因素，只要把称重的最后结果乘以一个系数即可得到最终体积。这里可以提供这个系数：在20-25℃范围内，这个系数的范围是1.0029-1.0040，每增加0.5℃,系数增加0.0001。

5． 维护和校准

发现有异常的，其维护的内容包含：

（1） 移液器外观有异常的，修复或更换相应部件；

（2） 量程调节不顺畅的，拆开上半部分清洁或更换部件；

（3） 吸液按钮分档不清晰的，检查及更换移液器中部之弹簧；

（4） 气密性不理想的，拆开下半部分检查活塞和密封圈等密封装置，清洁或更换；

(5) 其它的可能情况。

确认没有异常的，还有两种情况：

（1） 测试及计算后精度合乎要求（一般建议参照厂商的出厂数据）的，拆开下半部分清洁活塞、涂润滑剂，每年更换一次密封圈；

（2） 测试及计算后精度不符合要求的，用专用工具小心调整移液器上端的定量螺丝。

6． 重新测试和计算

凡有以下情形的，均需要重新进行测试和计算：移液器上半部分曾拆开过的、更换过移液器中部弹簧的、更换活塞的、更换套柄的和调整过定量螺丝的。而调整定量螺丝尤其是个细活，经常需要测试和计算多遍。

总之一句话，所谓校准，就是要保证移液器各部件无异常和精度合乎要求，否则就不是完整的校准。

7． 多道移液器的校准

多道移液器的校准要求与单道移液器的相同，通常有两种方法：其一，对多道移液器逐道进行校准，步骤与单道移液器完全相同。这是最常用的办法，但非常繁复；其二，用专门的多道移液器校准天平（如梅特勒－托利多公司的MCP系列天平），快捷但成本高。

另外，有的机构用多道移液器移取含一定浓度荧光物质的溶液，然后用光谱测定各道移取的荧光物质的含量，从而判断各道准确与否。这也是各有效的办法，但目前尚且没有这方面的校准标准。