常用分子生物学实验方法

6）CaCl2 悬浮 以2ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打，充分悬浮，冰浴30min 即感
受态制备完成。
此时感受态可直接使用或冰浴过夜第二天使用或加入10%的灭菌甘油，混匀后
-80℃冻存，以后使用(一般可存1 个月)。
注： 制备感受态细胞要求严格控制温度，制备过程在冰上操作。
2.5.2 转化(PGEM-T vector)
1) 准备1.5ml 的离心管，冰浴预冷。
2) 取100ul 感受态细胞，加入5ul 连接液，冰浴45-60min。
3) 42℃热刺激90sec。(此关键步骤，一定注意温度及时间)
4) 冰浴2min。
5) 加LB 培养基900ul，37℃，150rpm 培养45-60min。
6) 4000rpm×3min 离心。
7) 留100ul 上清，弃多余部分，混匀，涂布到含氨苄青霉素的LB 板(预先涂
布X-gal 和IPTG)。
8) 37℃ 培养箱倒置培养过夜，约16 小时。
2.6 接菌
1） 转化得到蓝白菌落筛选板 (因为我们一般用的是PGEM-T 做连接，经X-gal
处理后，有插入片段的显白色；载体自连的显蓝色，因此得到筛选。)
2） 挑取白色的菌落接到含氨苄青霉素的LB 培养基。
3） 37℃，260rpm 培养。
4） 培养5-6 小时后挑取2ul 菌液为模板做PCR 鉴定。
5） 以PCR 结果，将有目的片段插入的样品以5ml LB 培养基再次接菌，37℃，
260rpm 培养过夜，约16 小时。
2.7 阳性克隆鉴定 (PCR 鉴定)
2.7.1PCR 鉴定体系
第一章 基因克隆
10X Taq buffer 3 ul
4X dNTP (10mM) 0.5 ul
Taq DNA polymerase(5U/ul) 0.2ul(1U)
10uM引物 (双向) 各1ul
50%DMSO(which is optional) 1ul
模板：过夜菌液 / 挑单克隆 2ul
加灭菌水至 30ul
2.7.2 PCR 鉴定程序：
94℃ 5min
94℃ 30s
30cycle 55℃ 30s
72℃ 3min
72℃ 10min
4℃ +∞
30ul 上样，走电泳(以100bp plus marker 为对照)→核对片断大小
2.8 质粒抽提 (质粒小量抽提试剂盒)
1) 收菌 以10000 rpm ×1 min 离心收菌。(一般抽提一份用3-4ml 菌液)
2) 弃上清。
3) 加100ul 冰浴Solution I(含Rnase A)，涡旋振荡，使菌体充分悬浮。
4) 加200ul Solution II，温和混匀6 次。(此过程不超过5min)
5) 加280ul Solution III，温和混匀6 次。
6) 以14000 rpm×10 min 离心。
7) 取上清，过吸附柱，以10000 rpm×1 min，弃滤液。
8) 吸附柱内加450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，弃滤液。
9) 反复步骤8)一次。
第一章 基因克隆
10) 14000 rpm×1 min 离心。
11) 将吸附柱旋转180 度后再14000 rpm×1 min 离心。
12) 加40ul 50℃预热的ddH2O(或EB buffer)于吸附柱的膜中央，室温静置
2min。
13) 14000 rpm×1 min 离心并收集洗脱液，即质粒DNA。
2.9 测 序
1) ABI377 测序仪测序。
2) 测序结果分析：用软件Vector NTI Suite 6 分析测序结果。每个克隆相应的测
序结果，分析结果，存储信息分类输入数据库http://192.168.0.2/index.htm。
克隆信息管理系统。将测序完成的克隆编号入库。
3. 基因克隆的编码
根据实验基因引物的号码相对应编制。
如：基因引物编号： 1000_f 1000_r
克隆编号： 1000A1 or 100092
(注：号码倒数第二位为日期编号： 1—9 为阿拉伯数字 10=A,11=B,12=C…
最后一位为克隆数编号，一般为1—3)