外标法，内标法，面积归一化法，分析时如何选择？

应助达人

用的最多是外标法和内标法

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农残检测主要用外标法。

应助达人

液相外标法多些
气质内标法多些吧

1. 归一化法
如果试样中所有组分均能流出色谱柱并显示色谱峰，则可用此法计算组分含量。设试样中共有n个组分，各组分的量分别为m1，m2，……，mn，则i种组分的百分含量为：


归一化法的优点是简便、准确，进样量的多少不影响定量的准确性，操作条件的变动对结果的影响也较小，对组分的同时测定尤其显得方便。缺点是试样中所用的组分必须全部出峰，某些不需定量的组分也需测出其校正因子和峰面积，因此应用受到一些限制。
2. 内标法
当试样中所有组分不能全部出峰，或只要求测定试样中某个或几个组分时，可用此法。
准确称取m(g)试样，加入某种纯物质ms(g)作为内标物，根据试样和内标物的质量比ms/m及相应的色谱峰面积之比，基于下式可求组分i的百分含量Wi%：
因为
所以
内标物的选择条件是：内标物与试样互溶且是试样中不存在的纯物质；内标物的色谱峰既处于待测组分峰附近，彼此又能很好地分开且不受其它峰干扰；加入量宜与待测组分量相近。
内标法的优点是定量准确，操作条件不必严格控制，且不象归一化法那样在使用上有所限制。缺点是必须对试样和内标物准确称重，比较费时。
3. 外标法(亦称标准曲线法)
该法是在一定色谱操作条件下，用纯物质配制一系列不同的浓度的标准样，定量进样，按测得的峰面积对标准系列的浓度作图绘制标准曲线。进行试样分析时，在与标准系列严格相同的条件下定量进样，由所得峰面积从标准曲线上即可查得待测组分的含量。
外标法的优点是操作和计算简便，不需要知道所有组分的相对校正因子，其准确度主要取决于进样量的准确和重现性，以及操作条件的稳定性。

yifan老师，在分析测试前，您如何知道，是否样品中所有的组分都能出峰呢？如果不能确定，那是不是用面积归一化法有一定风险呢？

另外，内标法，对于内标物的要求，是不是不需要像一般标准品或者对照品的那么严格，必须有证书，知道纯度和有效期等信息。

我这边有碰到，一些用作内标的物质，仅作为内标物，不能用于定量。

这种内标物和我们讨论的内标法，用到的内标物，是同一类吗？

各位老师，怎么看？

雾老师，农残的话，用GC/ECD的应该比较多吧？

多用外标 要是基于哪方面的考虑呢？

应助达人

选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。


内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。
选择内标物有4个要求：1.内标物应是该试样中不存在的纯物质；2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；3.加入内标物的量应接近于被测组分；4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。
内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。
外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。

内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效率等等问题，我想简单而有效进行定量分析来满足要求才是最重要的。


1 按照GMP方法验证对于精密度的要求，同一样品进6针以上的RSD（RSD=STDEV（）/AVERAGE（）。即：相对标准偏差（RSD）=标准偏差（SD）/平均值，是用来衡量一组平行数据的精密度的。）和配制6个样品的定量结果RSD都能满足小于1.5%的要求，那么这个方法用外标法就是完全适用的，但是前面的影响因素是一定要都考虑到的，否则谈论这个方法是否适用就有失偏颇了。内标与外标都有（他们用的都是自动进样）精密度都能满足RSD小于1.5%的要求，当一个方法能够满足测试要求的时候，无论内标外标，都是可行的，当然有一个分析成本和分析时间的问题，内标的成本和控制溶液、样品溶液的配制当然要比外标要高和麻烦一些了。而有些时候，可能受你实验室现有仪器和附属设备的影响，达不到一定的要求，而还必须进行定量分析，有时外标的结果可能就要差一些，这时，你可能就要考虑用内标法了，可以排除手动进样的误差、分流歧视的影响、包括一些未知因素平行误差的影响，这时内标可能就显示出它的优势来了。


2、上面已经提到当做方法验证的时候，当同一样品配制6个样品溶液用所选用的外标法进行定量的时候，RSD都满足1.5%的要求时，也分为两种情况，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的结果小于1%，那这个方法就没有什么可以怀疑的了；如果RSD的结果大于1%而在1.5%略低一些的范围活动时，这个方法的可行性就将受到质疑，毕竟这是方法验证，你就要考虑上面1所提到的影响因素的影响了，如果排除掉以上的影响因素，RSD还是在1.5%附近，就要尝试内标了，如果内标结果的RSD很好，就证明你的这个方法受实验条件的影响很大，只能用内标了，或者干脆将原方法做大的变动，再尝试用外标法测试。


3、而对于微量分析，比如农药和兽药残留的分析、环境分析等，根据不同的限量标准要求对于精密度的要求也比常量分析的要求要宽松的多，RSD有时可以允许达到10%甚至更高，这时可能外标法有更大的应用空间。


4、单从精密度方面去考虑，排除其它成本和效率的因素，个人认为还是内标优于外标。曾经做过一个中间体二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺为内标，RTX-5
amine（碱改性）
15m*0.32mm*1.0um色谱柱分析，将配制好的控制溶液（含有内标物）自动进样器进6针，目的物（二氨基丙醇）与内标物（二乙醇胺）峰面积比率的RSD为0.18%，而只对这六针样品的目的物峰（二氨基丙醇）面积求RSD，结果为0.71%，通过这一实例的结果大家就会发现到底哪个方法精密度更好了，当然是内标更好了。当然这个化合物的检测方法最后根据上面的验证数据用内标和外标定量都是可以的，实验室可以自由选择。但内标与外标精密度结果的差异是显然存在的事实。
结论：应用外标法能够满足要求，首选还是外标法了，毕竟简单而省事。对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下，用内标法还是必要的。无论应用那种方法，方法的验证和确认都是很重要的，只要是按照程序经过验证和确认的方法，都有其应用的空间的。

HPLC方法建立的步骤：
（1）有关样品的情况，明确分离目的
（2）是否需要特殊的HPLC步骤、样品预处理等？
（3）选择检测器和检测器设置
（4）选择液相色谱法；进行预实验；估计最佳分离条件
（5）优化分离条件
（6）检查出现的问题或所需的特殊步骤
（7）定性方法；定量校正
（8）论证方法使之进入常规实验室
2，开始前应知道
2.1 样品的性质
包括：所含化合物的数目；化合物的化学结构（官能团）；化合物的分子量；化合物的pKa值；化合物的UV光谱图；化合物在样品中的浓度范围；样品的溶解度等。
两种模式：
（1）理论型：依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件；
（2）经验型：直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意。
2.2 分离的目的
（1）主要目的是定量分析？一种物质的检出？未知样品组分的确认？
（2）是否有必要解析出样品的所有成分？
（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品的主要成分的精密度通常能达到±1~2%
（4）该方法应设计多少种不同的样品基质？
（5）一次将分析多少样品？当一次分析的样品数超过10个时，运行时间一般应控制在20min以内
（6）即将使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？实验人员操作技能如何？色谱柱能否恒温？HPLC系统能否做梯度洗脱？
3，样品的预处理与检测
（1）可直接进样的溶液
（2）需稀释、pH缓冲、加入内标或其它定容操作的样品。（当样品溶剂成分接近流动相时，一般不会产生基线波动等问题）
（3）必须首先溶解或提取处理的固体
（4）样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害
检测器：首选可变波长紫外（UV）检测器。
4，建立分离方法
4.1 选择HPLC分离模式与起始条件
样品：一般样品：小分子（分子量小于2000）可分为中性样品和离子样品（酸、碱、两性化合物和有机盐类）
特殊样品：大分子、无机离子、对映体、生物样品、蛋白质、肽类等
首次HPLC分离的较好实验条件
分离条件 较好的首要选择
色谱柱
尺寸（长度，内径） 15×0.46cm
粒度 5μm
固定相 C8或C18
流动相
溶剂A和B 缓冲液—乙腈
%B 80~100%
缓冲液（化合物、pH、浓度） 25mM磷酸钾，2.0＜pH＜3.0
添加剂（如胺改性剂、离子对试剂） 开始时不用
流速 1.0~2.0mL/min
温度 35~45℃
样品大小
体积 ＜25μL
重量 ＜100μg
主要HPLC方法的特性
方法/特点/色谱柱 何时应该使用该方法？
反相HPLC
流动相：水-有机溶剂
色谱柱：C18（ODS）、C8、苯
基、三甲基硅烷（TMS）、氰基 能溶于水-有机混合物的大多数样品，尤其是中性或非离子化合物的首选
离子对HPLC
流动相：水-有机溶剂，控制pH
的缓冲液和离子对试剂
色谱柱：C18、C8、氰基 离子或可电离的化合物，尤其是碱或阳离子样品的良好选择
正相HPLC
流动相：有机溶剂混合物
色谱柱：氰基、二醇基、氨基、
硅胶 当反相或离子对HPLC无效时的第二个良好选择；不溶于水-有机混合物的亲脂样品的首选
4.2 开始方法建立
用上表的起始条件，在首次进样之前，唯一需做的选择是流动相中的有机调节剂比例（%B）。通常不推荐用中等强度的流动相开始方法建立。更好的选择是先用非常强的流动相（如80-100%B），然后按需要降低%B。
另一种有别于起始等度分离的方法是梯度洗脱。其优点：（1）确定最好的方法是用等度还是梯度洗脱；（2）估计出下一次实验（等度）的最佳溶剂强度。
4.3 改善分离
HPLC方法建立的目标
目标 评论
分离度 精密和普适性好的定量分析要求Rs＞1.5
分离时间 ＜5~10min时日常工作较理想
定量 含量测定：≤2%；要求不高的分析：≤5%；痕量分析：≤15%
压力 （如果为新柱）＜150bar最好，＜200bar通常是基本的要求
峰高 大信噪比的窄峰最好
溶剂消耗 每次运行少用流动相最好
4.4 可重现的分离
在方法建立过程中改变实验条件(流动相、色谱柱、温度)时，必须经过足够长的时间使色谱柱在新流动相和温度下达到平衡。通常以10~20倍柱体积的新流动相冲洗色谱柱后，色谱柱可达到平衡。
检验：当前后两次重复实验的保留时间恒定后可认为已经达到柱平衡。如果未平衡好而进行实验则有可能得到错误的结果。
5，完善HPLC方法
5.1 定量与方法论证
进行全面论证通常需通过简略检查方法的专属性、线性、准确性、回收率、灵敏度等而实施。
5.2 解决出现的问题
方法建立和论证期间可能出现的问题
问题 评论
塔板数低 色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响
色谱柱易变性 色谱柱选择不对，二次保留的影响
色谱柱寿命短 色谱柱选择不对，样品需预处理
保留时间变化 色谱柱平衡不够，样品需预处理，键合相流失
定量精度差 需更好地校正，找出误差的来源
出现新的干扰峰 初始分离不够或初始样品无代表性
5.3 方法的普适性
普适性好的方法是指能容忍实验条件的微小变化、一般色谱工作者容易掌握、应用时也不必使用同一HPLC系统的方法，可移交他人使用。

看测定含量还是有关物质。