显微镜基本技术--切片的制作【2】

六、石蜡切片制备
（一）石蜡切片前的准备
1．切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。
2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。
3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。
4．载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（蛋白甘油、APES或多聚赖氨酸），根据染色方法选择不同的粘附剂。
5．准备好毛笔、镊子、染色架。
6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。
（二）石蜡切片
1．将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。
2．切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。
3．调整切片机上的切片厚度为4~7µm，然后切片。
4．切片可以是单张，也可以是连续切片形成蜡带
5．展片和捞片：
（1）直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片铺在小滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。
（2）温水漂浮法：此法用展片机或者用恒温水浴箱，先使水温保持在45~50℃，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置于展片器的水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然后捞片，并及时编号。
6．展好的切片在室温下稍微干燥后，放在40℃恒温烤箱中，小片组织30分钟即可，大的需12~24小时，烤干备用。
（三）注意事项
1．切片刀刃倾斜过大或过小都不能正常进行切片。
2．修整蜡块时要细心，看清楚组织在蜡块中的位置，以免将需要的组织修掉。
3．连续转动切片机的转轮时，速度一定要均匀，不能时快时慢，以免切片厚薄不一。
4．使用轮转式切片机切片时，是由下向上切，为得到定然整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬、脆难切的部分放在上端，如皮肤应将表皮部分向上，肠胃等组织应将浆膜面面朝上。
5．用展片器展片时，水温应根据使用的石蜡熔点进行了调整，一般低于石蜡熔点10~15℃；捞片的时候动作要轻、稍快。动作太大容易出现气泡。如果没有展片器可以用温水浴锅来代替。
6．单个切片要摆到载玻片的1/3与2/3交界处；连续切片的粘片顺序一般是从左到右，组织切片较小是，可以并列粘贴2~3条蜡带。
7．烤片的温度不宜过高；烤片的时间要合适。脑组织要待稍微晾干一些后，才能烤片，否则容易产生气泡影响染色和观察。
七、H-E染色
（一）步骤
1．脱蜡
二甲苯I 10分钟
二甲苯II 5分钟
2．水化
100%酒精I 5分钟
100%酒精II 5分钟
95%酒精I 5分钟
95%酒精II 5分钟
85%酒精 3分钟
75%酒精 2分钟
蒸馏水冲洗 1分钟
3．染色
苏木精染色 5分钟
自来水洗
盐酸酒精分化 15秒
自来水洗（镜检）
自来水洗 15分钟
0.5%伊红染色 1分钟
蒸馏水洗 2分钟
75%酒精 2分钟
85%酒精 2分钟
95%酒精I 5分钟
95%酒精II 5分钟
100%酒精I 5分钟
100%酒精II 5分钟
二甲苯I 5分钟
二甲苯II 5分钟
4．封片
中性树胶封片
上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡
（二）注意事项
1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的处理是不一样的。
2．染色过程中所用的时间要根据染色时的室内温度、染液的新鲜程度及实验室的实际情况等灵活掌握。在室温高、切片、染色液又是新配制的，染色时间就要短，反之时间就长。
3．伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。
4．在二甲苯脱蜡之前可以先在60℃烤箱内0.5~1小时，这样可以使切片粘附更牢固不易脱片，也有利于脱蜡。
5．二甲苯在HE染色中有脱蜡、透明的作用。二甲苯脱蜡的好坏主要取决于切片在二甲苯内放置的时间和脱蜡时的温度以及二甲苯的使用次数。染好的切片必须经过透明，有利于显微镜观察，同时并为封片起到了桥梁作用。
6．用梯度酒精脱水时，在低浓度酒精中时间不宜过长，到高浓度时逐步延长脱水时间。以免脱水不彻底，影响二甲苯透明的效果。
7．在酸性分化液内停留的时间不要过长，分化不可过度，避免使细胞核内该染上色的结构脱色。不需分化处理的苏木精染色时要注意掌握染色时间，以防止组织切片染色背景过深或细胞核、胞质染色不足。