2. 流式细胞仪的基本结构
流式细胞仪的结构可分为流动室及液流驱动系统;激光光源及光束成形系统;光学系统;信号检测与存贮、显示、
分析系统;细胞分选系统等五个部分。
(1) 流式细胞仪流动室与液流驱动系统
流动室是FCM的核心部件,被测样品在此与激光束相交。流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。
(2)流式细胞仪激光光源与光束成形系统
激光是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。激光光束在到达流动室前,先经过透镜将其聚焦,形成几何尺寸约为22μm
×66μm即短轴稍大于细胞直径的光斑。
(3)流式细胞仪光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成,它们分别将不同波长的荧光信号送入不同的电子探测器。
作为FCM光学系统中的主要光学元件的滤光片,主要分为长通滤片、短通滤片和带通滤片三类。
①长通滤光片
②短通滤光片
③带通滤光片
(4) 流式细胞仪信号检测与分析
① 散射光信号 散射光分为前向角散射和侧向角散射,散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色),称为细胞的物理参数
Ⅰ 前向角散射 前向角散射与被测细胞的大小有关,确切地说与细胞直径的平方密切相关。
Ⅱ 侧向角散射 侧向角散射是指与激光束正交900方向的散射光信号。侧向散射光对细胞膜、细胞质、核膜的折射率更为敏感,可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
②荧光信号 当激光光束与细胞正交时,一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号,称为细胞自发荧光;另一种是经过特异荧光素标记细胞后,受激发照射得到的荧光信号,通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的存在和定量。
Ⅰ 荧光信号线性测量和对数测量:
Ⅱ 荧光信号的面积和宽度
Ⅲ 光谱重叠的校正
从下图可以看出,阴影为探测器检测光谱的范围,FITC探测器会探测到少量的PE光谱,而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路,利用已知标准样品或荧光小珠,可合理设置荧光信号的补偿值。