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1.8 发酵酒中啤酒的饮用后的鉴别技术研究

dahua1981

2012/07/16

作者：温昕娟;（山西医科大学）
摘要：1．寻找啤酒中具有鉴别意义的特征性物质；
2．建立啤酒特征性物质的HP $$lc -M S / M S 的检测方法；
3．建立啤酒特征性物质的固相萃取方法 , 并比较不同固相萃取柱以及液液萃取方法的回收率区别，并选择最优的方法；
4．分别对各类发酵酒（包括啤酒、红酒和白酒）进行检测，确认所选特征性物质能
用来鉴别各种酒类，为饮酒后导致的各类案件的检材采取、检测、结果分析及法医学鉴定提供科学依据；
5．研究各种发酵酒饮用后，生物检材 (包括唾液、尿液和血液 ) 中通过对特征性物质的检测，推断是否饮用过啤酒。
方法
1．通过文献查新了解各种发酵酒中微量物质的差异以及啤酒特征性物质的初步确定；
2 ．啤酒特征性物质的 $$lc - MS / M S 检测条件的优化：采用保留时间 (R t ) 和多反应监测(M R M )对特征性物质进行定性定量分析。选择2- 3 对离子定性，以1对响应值相对较高的特征离子的峰面积其溶液浓度做标准曲线，用外标进行定量。
3 ．啤酒特征性物质的提取方法的优化：分别比较采取液液萃取和固相萃取方法方法的回收率，析固相萃取柱包括Waters Sep-Pk C18 和 proEl ut C18 6 cc (1 000 mg) 。分别分析不同的 PH条件下回收率，对洗涤溶剂和洗脱液做最优选择，建立固相萃取方法。
4．人体饮用各种发酵酒后，通过对人体生物样本中啤酒的特征性物质的研究, 甄别是否饮用啤酒的研究：
5．人体试验的实验设计健康自愿10 人受试前天禁酒，避免激烈的运动，保持良好的心态，将受试者随机分为三个实验小组：让自愿者饮酒前排尿作为空白对照，在 1小时内匀速饮酒达最大耐受量，边饮酒边进食，食物荤素搭配适当。自开始饮酒后两个小时自静脉采血 5 ~8 m L，并收集唾液约3m L, 在自愿者有尿意时收集中段尿，收集三次并对收集时间做详细记录，将采集的血液、尿液、唾液等人体生物本放置于 -2 0 冰箱中保存待检。
第一组志愿者 6 人，饮用啤酒；
第二组志愿者 2人，饮用红酒；
第三组志愿者 2人，饮用白酒。
6．生物样本的前处理及固相萃取
a. 检材的前处理：取出检材，解冻后高速离心， 4 00 0r / m i n的速度离心 3分钟，取离心后的上清液3mL，加入50m M (P H约为 3) 甲酸铵缓冲液 3mL，混匀备用；酒样超声除气40 min 加入甲酸调节 PH，放置备用；
b. 活化和平衡：取 Pro El ut C18 6 cc (1 000 0m g) 柱， 5 m L甲醇活化 4 m L水平衡，2 m L 甲酸铵缓冲液再活化，流速为 3m L/ min；
c. 上样：处理好的检材以 1m L/ min 的流速过柱；
d. 洗涤： 6m L 水洗后 50 mM (P H约为3) 3m L 甲酸铵缓冲液洗涤，流速为 2mL/min;
e. 吹干：用洗耳球吹干柱中残余的水分；
f. 洗脱： B 洗脱液进行洗脱，流速为1mL/ min；
g. 收集： 40℃下氮气吹2min， $$lc -M S / MS 分析，采用保留时间很特征性离子对定性定量分析。
7．统计学方法：实验数据结果以均数 ±标准差（X ± S）表示，用 SPSS 11.5 统计件
对检材中的α -酸含量进行方差分析。
结果
1. 黄腐酚经 HP $$lc / MS / MS 分析，结果表明在0. 5～4 0. 0 μg/ mL 范围呈现良好的线性关良好，相关系数R²为 0. 9929 ，最低检测限（LO D）为0. 5μ g/ mL 。
2. 异- α酸经液相分离，质谱分析，结果明在 0 .1 ～31. 16 3.0 μ g/ m L 范围内血液呈现良好的线性关系良好，相关系数 R分别为 0.9945 。异α -酸的标准溶液制成不同浓度，进行HP$$lc / MS / MS 分析，检测结果示最低检测限（LOD）为0.01μg/ mL, 信噪比（S /N）为4. 5 。
结论
1 ．据课本及文献报道：黄腐酚只存在于酒花中，所以啤酒黄腐酚的唯一来源，出于
这个原因，考虑黄腐酚能用来区别啤酒和其它酒种。不同的啤酒中黄腐酚含量不同，市售的大部分啤酒的黄腐酚含量小于0 .1 m g/ L ，国内外有相关的报道，检测到部分啤酒的黄
腐酚的含量超过 1mg/L，的甚至高达2m g/ L 。
2．经过固相萃取及高效液相色谱并联质谱对啤酒中黄腐酚的分析和检测，结果可知，
与报道相符，在大部分啤酒中的黄腐酚含量在0. 04 ~0 . 2 mg/ l ，对于经过特殊加工的啤酒会高一些。实验证明，啤酒中的这种物质如此微用现有的条件不足以鉴别是否喝过啤酒谱图（太多了就只传一个吧）

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