MAS-HPLC法测定鱼肉、牛奶和鸡蛋中的三聚氰胺

（Cleanert PAX,P/N:AX0100）

1 实验部分

1.1仪器与试剂
仪器：L6-1 系列高效液相色谱仪，三聚氰胺检测样品前处理方法包：（包括盐酸0.1 mol/L，6% 磺基水杨酸，混合型阴离子交换填料Cleanert PAX，（科技部“十一五”国家支撑计划成果, 天津博纳艾杰尔科技有限公司）；Venusil SCX-M，5μm,4.6×250mm 强阳离子交换色谱柱（科技部“十一五”国家支撑计划成果, 天津博纳艾杰尔科技有限公司）及保护柱；针式过滤器（Agela Clarinert，0.22/0.45µm，尼龙）；三聚氰胺标准品（>99%），均质器（T25 Basic，IKA）。试剂：所用乙腈为色谱纯；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。
1.2 色谱条件
色谱柱：Venusil SCX-M色谱柱，4.6×250mm,5μm,300 ；（科技部“十一五”国家支撑计划成果）；流动相：磷酸二氢钾（0.050mol/L）：乙腈=70：30；流速：1.5mL/min；柱温：室温；波长：240 nm；实验中若非特别注明，进样量均为20μL。 Å
1.3 三聚氰胺标准曲线工作液的配制
1.3.1三聚氰胺标准贮备溶液：1.00×10³ mg/L。
称取100 mg 三聚氰胺标准物质（准确至0.1 mg），用水完全溶解后，用水定容至100 mL，混匀。
1.3.2标准工作溶液
1.3.2.1 标准溶液A：2.00 ×102 mg/L。准确移取20.0 mL 三聚氰胺标准贮备溶液（1.3.1），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，待用。
1.3.2.2 标准溶液B：0.50 mg/L。准确移取0.25 mL 标准溶液A（1.3.2.1），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，待用。
1.3.2.3 标准工作液的配制 按表1 分别移取不同体积的标准溶液A（1.3.2.1）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，0.45μm滤膜过滤，待测。按表2分别移取不同体积的标准溶液B（1.3.2.2）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，0.45μm滤膜过滤，待测
表1 标准工作液配制（高浓度）

1.4 试样的制备
1.4.1牛奶样品
取15.0g牛奶置于25mL容量瓶中，加入0.1mol/L 盐酸10mL，加入6% 磺基水杨酸3.0 mL， 混合型阴离子交换树脂1.0g（Cleanert PAX），用0.1mol/L 盐酸定容至25mL，涡旋振荡2min，8000 r/min离心5min，取上清液过0.45μm的滤膜后进液相分析。
1.4.2鸡蛋样品
取10.0g混合均匀的鸡蛋置于25mL容量瓶中，加入0.1mol/L 盐酸10mL，均质后全部转入25mL容量瓶，加入6% 磺基水杨酸3.0mL，混合型阴离子交换树脂1.0g（Cleanert PAX），用0.1mol/L 盐酸定容至25mL，涡旋振荡2min，8000 r/min离心5min，取上清液过0.45μm的滤膜后进液相分析。
1.4.3鱼肉样品
取5.0g剁碎的鱼脊背肉，加入0.1mol/L 盐酸10mL，均质后全部转入25mL容量瓶，加入6% 磺基水杨酸3.0 mL，混合型阴离子交换树脂1.0g（Cleanert PAX），用0.1mol/L 盐酸定容至25mL，涡旋振荡2min，8000 r/min离心5min，取上清液过0.45μm的滤膜后进液相分析。

2结果与讨论
2.1 线性范围
低浓度曲线取0.005mg/L, 0.01mg/L, 0.02mg/L, 0.1mg/L, 0.2mg/L 5个浓度的标准样品测试，所得标准曲线如下图：

图1 低浓度标样线性
高浓度曲线取0.2mg/L, 0.5mg/L, 2mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 50mg/L 6个浓度的标准样品测试，所得标准曲线如下图：

图2 高浓度标样线性
结果表明：本方法在0.005mg/L~ 50.0mg/L和范围内，三聚氰胺峰面积和浓度有良好的线性关系

2.2 重复性
取浓度为5mg/L的标准品溶液，分别进样20μL，进样6次，计算保留时间及峰面积的RSD（相对标准偏差）。结果列于表3中

表3 保留时间和峰面积的重现性（精密度）

图3 重复性谱图
从表3和图3看出，该方法结果重复性良好。

2.3 检出限

以曲线最低点0.005mg/L的谱图（见图4）为准，以噪声对应峰高估算检出限为0.0032mg/L (S/N=3)。

图4 检出限谱图

2.4 实际样品测试
2.4.1牛奶样品
2.4.1.1空白牛奶样品测试谱图如图5：

图5 空白牛奶样品谱图

2.4.1.2 牛奶加标回收率

分别在空白牛奶样品中加入相当于1.0mg/Kg，5.0mg/ Kg和10.0mg/ Kg的三聚氰胺标准品，测试谱图如图6所示。

图6牛奶中添加不同浓度的三聚氰胺谱图

根据此谱图测得三聚氰胺的加标回收率如表4所示
表4 牛奶中三聚氰胺加标回收率试验结果

结果表明，MAS前处理方法对牛奶中三聚氰胺提取具有良好的回收率，杂质去除效果好；HPLC分析中三聚氰胺和杂质分离良好。

2.4.2鱼肉样品
2.4.2.1 空白鱼肉样品测试谱图如图7：

图7 空白鱼肉样品谱图
2.4.2.2 鱼肉样品加标回收率
分别在空白鱼肉样品中加入相当于1.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg的三聚氰胺标准品，测试谱图如图8和图9所示。

图8 鱼肉中添加三聚氰胺1.0 mg/kg谱图

图9 鱼肉中添加三聚氰胺10.0 mg/kg谱图
根据此谱图测得鱼肉中三聚氰胺加标回收率如表4所示
表5 鱼肉中三聚氰胺样品加标回收率试验结果

结果表明，MAS前处理方法对鱼肉中三聚氰胺提取具有良好的回收率，杂质去除效果好；HPLC分析中三聚氰胺和杂质分离良好。

2.4.3鸡蛋
2.4.3.1空白鸡蛋样品测试谱图如图10所示：

图10 空白鸡蛋样品谱图

2.4.3.2 鸡蛋加标回收率
分别在样品中加入相当于1.0mg/Kg，5.0mg/ Kg和10.0mg/ Kg的三聚氰胺标准品，测试谱图如图11所示。

图11 鸡蛋中添加三聚氰胺5.0 mg/kg

鸡蛋中三聚氰胺的加标回收率如表6所示
表6 鸡蛋中三聚氰胺加标回收率试验结果