【博艾聚焦】固相萃取-液质联用对化妆品中11种糖皮质激素的同时测定

yuduoling

2012/11/07

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摘要：建立了固相萃取-液质联用对化妆品中泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、倍他米松、地塞米松等11种糖皮质激素同时检测的方法。化妆品样品用乙腈提取后，经Cleanert^®PEP-2 SPE固相萃取柱配合卓睿^TM全自动固相萃取仪净化后，使用Venusil^®ASB C18色谱柱，经有液相的API 4000 PLUS三重四级杆质谱仪进行定量分析。在高低添加水平下，11种糖皮质激素的平均回收率为75%-120%；相对标准偏差均小于13% 。

关键词：糖皮质激素；化妆品；固相萃取；液质联用

糖皮质激素是临床常用的一类药物，对皮肤病有良好的消炎作用，可抑制纤维细胞增生，减少5-羟色胺的形成，因此其在短时间使用对皮肤有一定的嫩白作用^【¹^】。但长期使用则会发生皮肤变薄、毛细血管扩张、毛囊萎缩，一旦停用，皮肤就会发红、发痒，出现红斑、皮疹等。因此我国《化妆品卫生规范》^【²^】明确规定此类物质为禁用成分。目前糖皮质激素的检测多集中在药品中有效成分和尿液中糖皮质激素的检测^【^3-4^】，化妆品中糖皮质激素的检测文献报道的较少。本文采用Cleanert^® PEP-2 SPE配合卓睿全自动固相萃取仪净化的方法，建立了一种化妆品中泼尼松、泼尼松龙、可的松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、醋酸可的松、醋酸泼尼松、醋酸氢化可的松、曲安奈德11种糖皮质激素同时检测的方法。

一．实验方法

1.1.实验试剂和材料

1.1.1糖皮质激素类药物标准品（详见表1）

表1 糖皮质激素类药物标准品信息

中文名	英文名	CAS号	相对分子质量
泼尼松龙	Prednisone	50-24-8	360.1937
氢化可的松	Hydrocortisone	50-23-7	362.2093
泼尼松	Prednisone	53-03-2	358.1780
可的松	Cortisone	53-06-5	360.1937
甲基泼尼松龙	Methylprednisolone	83-43-2	374.2093
倍他米松	Betamethasone	378-44-9	392.1999
地塞米松	Dexamethasone	50-02-2	392.1999
曲安奈德	Triamcinolone acetonide	76-25-5	434.2105
氢化可的松醋酸酯	Hydrocortisone 21-acetate	50-03-3	404.2200
泼尼松醋酸酯	Prednisone 21-acetate	125-10-0	400.1886
可的松醋酸酯	Cortisone 21-acetate	50-04-4	402.2042

1.1.2实验试剂（详见表2）

表2 实验试剂

试剂名称	品牌	规格
甲醇	天津博纳艾杰尔科技	质谱纯，2.5L/瓶
乙腈	天津博纳艾杰尔科技	质谱纯，2.5L/瓶
水	天津博纳艾杰尔科技	质谱纯，2.5L/瓶

1.1.3仪器和设备（详见表3）

表3 实验用仪器和设备

设备名称	品牌	规格/型号
串联质谱仪	AB SCIEX	API 4000+
高效液相色谱仪	安捷伦	1260
Venusil^® ASB C18液相色谱柱	天津博纳艾杰尔科技	2.1×150mm 3µm 150Å
分析型柱温箱	天津博纳艾杰尔科技	>室温5℃~70℃
卓睿全自动固相萃取仪	天津博纳艾杰尔科技	SPE-40
Cleanert^® PEP-2 固相萃取小柱	天津博纳艾杰尔科技	150mg/6mL
针孔过滤器（尼龙）	天津博纳艾杰尔科技	0.22um，13mm
分析天平	赛多利斯	0.1mg，220g
高速离心机	上海华亭	50mL*6
涡旋振荡器	Vortex-genie	230/240VAC 50HZ
氮吹仪	天津博纳艾杰尔科技	15位

1.2.糖皮质激素类药物标准溶液配制

1.2.1标准贮备液

分别精密称取适量的11种糖皮质激素标准品，用甲醇溶解定容，分别配制成1000μg/mL的贮备液。-20℃以下保存。

1.2.2混合标准工作液

准确量取糖皮质激素类药物标准贮备液适量，用20%乙腈水溶液稀释成适宜浓度的混合标准工作液。现配现用。

1.3.实验试剂的配置

1.3.1 10%亚铁氰化钾溶液：称量2.3g K4Fe(CN)6•3H2O，用水溶解定容至20mL；

1.3.2 20%乙酸锌溶液：称量4.78g C4H6O4Zn•2H2O，用水溶解定容至20mL；

1.3.3定容液：量取70mL水和30mL乙腈，混匀后加入100µL甲酸混匀。

1.4.测定步骤

1.4.1提取

霜膏类化妆品：称取0.2g试样（精确至0.01g）于50mL离心管，混匀。加入3mL饱和氯化钠溶液，涡旋混合使样品分散，加入3mL乙腈，超声提取5min，8000r/min离心5min，吸取上层清液于另一50mL离心管中，下层氯化钠溶液用2mL乙腈重复提取一次，合并二次乙腈提取液，往提取液加入40mL去离子水，混匀，加入亚铁氰化钾溶液0.2mL，混匀，加入乙酸锌溶液0.2mL，混匀，8000r/min离心10min，作为待进化液。

精油类样品：称取0.5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管，混匀。加入4mL正己烷，涡旋混合使样品分散，加入4mL50%乙腈水溶液，涡旋提取2min，8000r/min离心5min，吸取下层提取液，上层正己烷用4mL50%乙腈水溶液重复上述提取步骤一次，合并二次50%乙腈提取液，往提取液加入36mL去离子水，混合，加入亚铁氰化钾溶液0.1mL，混匀，加入乙酸锌溶液0.1mL，混匀，8000r/min离心10min，作为待进化液。

1.4.2净化

将PEP-2固相萃取小柱置于卓睿全自动固相萃取仪，上样液转移至上样管中，溶剂置于相应的溶剂瓶中，设定操作程序如下：用5mL甲醇、10mL水活化。将上样管中溶液全部上样，然后以10mL10%乙腈水溶液淋洗小柱，待清洗液自然流尽后，通气吹干小柱中的残留液（5min）。最后以6mL甲醇洗脱小柱，待甲醇自然流尽后，通气吹干小柱中的残留液（5min），以上操作流速均设定为1mL/min。取出收集瓶，于40℃氮气吹干，用1mL定容液溶解定容，过0.22µm尼龙滤膜，待测。

1.4.3测定

1.4.3.1液相色谱条件

色谱柱：Venusil^® ASB C18 3μm 150Å 2.1*150mm；柱温：30℃；进样量：10μL。

流动相：A相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的乙腈溶液；

梯度洗脱程序见表4

表4 流动相梯度洗脱条件和流速

时间 min	流速 μL/min	A相 %	B相 %
0.00	200	68	32
3.00	200	68	32
10.00	200	25	75
15.00	200	15	85
15.01	200	68	32
25.00	200	68	32

1.4.3.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；

IS：-4500V；GS1：55Psi；GS2：55Psi；TEM：550℃；

糖皮质激素类药物多反应监测的优化参数见表5

表5 糖皮质激素类药物多反应监测的优化参数

药物名称	保留时间/min	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
泼尼松龙	6.22	405.1/329.1	-40	-10	-20	-9
		405.1/359.2	-40	-10	-20	-9
氢化可的松	6.35	407.2/331.1	-30	-10	-22	-9
		407.2/361.1	-30	-10	-22	-9
泼尼松	6.29	403.1/326.9	-50	-10	-18	-9
		403.1/357.2	-50	-10	-18	-9
可的松	6.66	405.1/329.1	-40	-10	-20	-9
		405.1/359.2	-40	-10	-20	-9
甲基泼尼松龙	9.02	419.2/343.0	-40	-10	-22	-9
		419.2/373.0	-40	-10	-22	-9
倍他米松	9.55	437.2/361.3	-60	-10	-22	-1
		437.2/391.1	-65	-10	-22	-1
地塞米松	10.04	437.2/361.3	-60	-10	-22	-1
		437.2/391.1	-65	-10	-22	-1
曲安奈德	12.22	479.1/413.4	-60	-10	-24	-11
		479.1/337.1	-40	-10	-24	-11
氢化可的松醋酸酯	12.9	449.2/403.0	-50	-10	-16	-11
		449.2/373.0	-50	-10	-16	-11
泼尼松醋酸酯	13.42	447.2/401.1	-45	-10	-18	-9
		447.2/371.2	-50	-10	-18	-9
可的松醋酸酯	12.30	445.2/339.1	-40	-10	-16	-9
		445.2/369.3	-45	-10	-16	-9

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

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yuduoling

第1楼2012/11/07

二．结果与讨论

2.1.净化条件的选择

目前文献报道的净化方法多选用聚合物基质的吸附性材料或硅胶基质的ODS SPE小柱。本文选用Cleanert^® PEP-2 SPE小柱，实验结果表明其可同时对11种糖皮质激素有很好的吸附。

考察了不同体积分数0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%乙腈的水溶液的洗脱效果，结果表明使用10%乙腈的水溶液，可保证11种糖皮质激素不被洗脱下来，所以最终选用10%乙腈的水溶液做淋洗液，并且在上样之前要用水将乙腈的提取液稀释。

卓睿全自动固相萃取仪的使用，大大提高样品前处理的效率，同时减少人为操作的误差，保证结果的重现性。

2.2.液相色谱柱的选择

在本文要同时检测的11种糖皮质激素中，可的松和氢化可的松、倍他米松和地塞米松为同分异构体，在反相液相色谱中比较难分离。通过比较不同C18的分离效果，最终选用Venusil^® ASB C18（3µm，150Å，2.1×150mm）为色谱柱，可保证11种糖皮质激素在15min内均达到基线分离。

2.3.准确度和重现性

以市售玫瑰精油和护手霜为基质，进行添加回收实验，进行0.1μg/g和0.05μg/g添加浓度的实验，11种糖皮质激素的回收率均在75%-120%之间，具体实验结果请见下列表格：

表6 玫瑰精油0.1µg/g添加回收实验结果

药物名称	平行1	平行2	平行3	平均回收率	RSD
泼尼松	85.19%	85.65%	76.98%	82.61%	5.90%
泼尼松龙	91.68%	90.70%	81.07%	87.82%	6.68%
可的松	93.67%	92.11%	82.38%	89.39%	6.84%
氢化可的松	84.56%	89.38%	86.89%	86.94%	2.77%
甲基泼尼松龙	94.08%	82.90%	84.75%	87.24%	6.87%
倍他米松	89.74%	90.28%	80.51%	86.84%	6.33%
地塞米松	103.10%	93.90%	89.10%	95.37%	7.46%
可的松醋酸酯	87.19%	87.40%	92.02%	88.87%	3.07%
泼尼松醋酸酯	119.07%	119.86%	111.63%	116.85%	3.89%
氢化可的松醋酸酯	91.12%	91.69%	87.43%	90.08%	2.57%
曲安奈德	98.72%	84.57%	87.15%	90.14%	8.36%

表7玫瑰精油0.05µg/g添加回收实验结果

药物名称	平行1	平行2	平行3	平均回收率	RSD
泼尼松	78.32%	75.44%	86.69%	80.15%	7.29%
泼尼松龙	85.75%	85.75%	86.16%	85.88%	0.28%
可的松	86.99%	77.29%	88.46%	84.25%	7.20%
氢化可的松	72.36%	69.15%	75.04%	72.18%	4.08%
甲基泼尼松龙	84.80%	88.74%	99.95%	91.16%	8.62%
倍他米松	76.19%	85.32%	95.32%	85.61%	11.18%
地塞米松	80.38%	79.99%	90.64%	83.67%	7.22%
醋酸酯可的松	86.52%	93.17%	107.36%	95.68%	11.13%
泼尼松醋酸酯	119.39%	107.72%	111.49%	112.87%	5.28%
氢化可的松醋酸酯	94.54%	110.02%	103.75%	102.77%	7.58%
曲安奈德	94.10%	73.98%	90.74%	86.27%	12.49%

表8护手霜0.1µg/g添加回收实验结果

药物名称	平行1	平行2	平行3	平均回收率	RSD
泼尼松	98.47%	96.35%	87.64%	94.16%	6.09%
泼尼松龙	104.71%	106.49%	100.10%	103.76%	3.18%
可的松	99.64%	93.01%	97.16%	96.60%	3.47%
氢化可的松	91.60%	90.07%	95.88%	92.51%	3.26%
甲基泼尼松龙	107.41%	102.56%	101.39%	103.79%	3.07%
倍他米松	105.77%	100.40%	105.90%	104.02%	3.02%
地塞米松	99.96%	97.00%	100.11%	99.02%	1.77%
可的松醋酸酯	124.48%	119.24%	111.62%	118.44%	5.46%
泼尼松醋酸酯	104.31%	93.72%	90.30%	96.11%	7.60%
氢化可的松醋酸酯	103.96%	114.47%	114.17%	110.86%	5.40%
曲安奈德	94.97%	111.77%	93.30%	100.01%	10.22%

三．实验结论

使用Cleanert^® PEP-2、Venusil^® ASB C18建立了一种化妆品中11种糖皮质激素同时检测的分析方法，实验结果表明本方法快速、准确，可用于化妆品中糖皮质激素的检测。

参考文献

【1】郑星泉，周淑玉，周世伟。化妆品卫生检验手册。北京：化学工业出版社，2003.294

【2】化妆品卫生规范。2007.34

【3】左志辉，周建玉，左文坚。药物分析杂志。2004,24（4）：420

【4】张林，孙子林。中国药物与临床。2006,6（1）：76

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yifan1117

第2楼2012/11/07

原来这是嫩白的效果呀。

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yuduoling

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附图

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yuduoling

第4楼2012/11/07

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maggiesea

第5楼2012/11/07

LZ您好！感谢您对我们的关注。其实这篇文章论坛上已经发过啦，不过真遗憾关注和回复都不如您的高呢~偶就自作主张把您文章的格式编辑了一下，希望能让版友们看起来更方便，也希望更多版友支持哈~
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yuduoling

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多谢版主。
maggiesea(maggiesea) 发表:LZ您好！感谢您对我们的关注。其实这篇文章论坛上已经发过啦，不过真遗憾关注和回复都不如您的高呢~偶就自作主张把您文章的格式编辑了一下，希望能让版友们看起来更方便，也希望更多版友支持哈~

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dahua1981

第7楼2012/11/07

应助达人

原来是yu老师的大作啊
maggiesea(maggiesea) 发表:LZ您好！感谢您对我们的关注。其实这篇文章论坛上已经发过啦，不过真遗憾关注和回复都不如您的高呢~偶就自作主张把您文章的格式编辑了一下，希望能让版友们看起来更方便，也希望更多版友支持哈~