抗生素微生物检验标准操作规程

省部重点实验室

2013/05/12

私聊

生命科学仪器综合讨论

关键词：抗生素关碟法效价 SOP
目的：建立一个抗生素微生物管碟测定法检验标准操作规程，确保检验结果可靠。适用于抗生素效价的检验。
主体内容：
1.检查：
1.1仪器于用具：培养箱、恒温水浴锅、、钢管、陶瓦盖、滴定管、双碟、抗生素Ⅰ号培养基、刻度吸管、容量瓶、大烧杯、天平、游标卡尺、称量瓶等。
1.2准备工作：
1.2.1将双碟、滴定管、20ml刻度吸管、10ml刻度吸管、5ml及2ml刻度吸管各1支，钢管、镊子置于贮槽中，在干燥箱250℃灭菌30min，陶瓦盖烘干，应保持其清洁干燥。
1.2.2培养基配置：所有培养基为抗生素效价Ⅰ号培养基，根据其配制说明配制。灭菌，分装到 100ml及200～300ml的锥形瓶中，备用。临用前用水浴溶化。
1.2.3菌悬液的配制：取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物加灭菌水1－2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀摊布，在30—35℃培养7日。取菌苔少许涂片，革兰染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水10ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在70－75℃水浴内加热30min将菌体杀死，待冷后放冰箱贮藏为浓菌液。日常用菌悬液，取上述浓菌悬液，用灭菌水1：3稀释至灭菌试管中，冰箱保存备用。每次试验前，所加量应根据每次实验情况而定。灵活掌握。
1.2.4标准品、供试品配制：
1.2.4.1标准品配制：精密称定标准品粉末0.039g置25ml容量瓶中，用灭菌水定溶。即1000u/ml。从1000u/ml的溶液中移取2ml至200ml容量瓶中，用灭菌水定溶，此时溶液为10u/ml;在从1000u/ml的溶液中移取1ml至200ml容量瓶中，用灭菌水定溶，此时溶液为5u/ml.
1.2.4.2供试品配制：（原料）精密称定原料粉末0.01560g置10ml容量瓶中，用灭菌，水定溶即1000u/ml。从1000u/ml的溶液中移取1ml置100ml容量瓶中用灭菌水，定溶此时溶液为10u/ml,再从1000u/ml的溶液中移取1ml至200ml容量瓶中。用灭菌水定溶，此时溶液为5u/ml。
1.2.5成品：取成品20片，精密称定，算出平均片重，研细。取平均片重的二倍半粉末（即10万个效价单位）置100ml容量瓶中用灭菌水定溶即1000u/ml。从1000u/ml溶液中移取1ml置100ml容量瓶中，用灭菌水定溶即10u/ml。再从1000u/ml溶液中移取1ml至200ml容量瓶中，用灭菌水定溶即5u/ml。
2.操作方法：
2.1双碟的制备：在无菌室内进行，培养基应在水浴中融化，避免直火加热。
2.2底层：用灭菌大口吸管（20ml）取已融化的培养箱20ml注入双碟内，等凝固后更换干燥的陶瓦盖，放入35－75℃培养箱中保温，使高于摊布菌层。
2.3菌层：取出试验用菌悬液，按已试验要的菌用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中(60℃)的培养基内，摇匀作为菌层用。用5ml刻度吸管吸取菌层培养基5ml，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上，用陶瓦盖覆盖，放置20～30min待凝固备用。
2.4放置钢管：用干热灭菌的镊子将已灭菌的钢管平稳放在双碟中，使4个钢管成等距。钢管放妥后，应使双碟静置5－10min，再开始滴加抗生素溶液。
2.5滴加抗生素溶液：每批供试品取4－10个双蝶，用毛细滴管加样。在滴加之前须用滴加液洗2－3次，在双碟的4个钢管中成对角滴加标准品（Ｓ）及供试品（Ｔ）高（H）低（L）两种浓度的溶液。滴加顺序是：SH→TH→SL→TL。滴加至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。将已滴完的双碟移入培养箱内36.5℃培养16h。
3.抑菌圈测量：
3.1将培养妥的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管倒入盛有1：1000苯扎溴铵溶液或其它消毒液内，换以玻璃盖，用游标卡尺测量，测量时，眼睛视线应与读数刻度垂直，用尖端与抑菌圈直径的切点成垂直方向测量。
4.记录与计算：
4.1将抑菌圈不规整的弃之，选择教好的整理参加计算。
根据公式 Log-1[T2+T1-S2-S1/T2+S2-T1-S1]×0.301×100%
5.注意事项：
5.1称量要迅速，研磨时要注意环境干燥。
5.2 配制药液时应注意环境，防止污染。
5.3 滴加抗生素溶液时要用中心浓度向高低两端交叉滴加，滴加要迅速。
6. 检验依据：2005年版《中国药典》二部附录

分
该帖子已被版主-zhang8826857加2积分，加2经验;加分理由:鼓励分享