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HPLC法测定当归四逆汤合煎液与单煎 合并液中阿魏酸和芍药苷的含量
haiyang
2014/07/31
私聊
液相色谱(LC)
HPLC
法测定当归四逆汤合煎液与单煎
合并液中阿魏酸和芍药苷的含量
目的
:
建立测定中药复方当归四逆汤主要成分含量的方法,比较当归四逆汤合煎液与单煎合并液中阿魏酸和芍药苷的含量差异。
方法
:采用
HPLC
分析,色谱柱为
YWG—C18
色谱柱(
4.6mm
×250mm
,
5μm
)。分析阿魏酸含量:流动相为水
:
乙腈
=83
:
17
,流速为
1.0mL/min
,柱温为
30
℃
,检测波长
230nm
,进样量为
20μl
。分析芍药苷:流动相为
0.01%(v/v)
磷酸水溶液
:
乙腈
=95
:
5
,流速为
1.0mL/min
,柱温为
30
℃
,检测波长
230nm
,进样量
20μl
。
结果
:
阿
魏酸和芍药苷分别在
3.375μ
g·mL
-1
~
67.5μ
g·mL
-1
,
0.8065μ
g·mL
-1
~
25.8000μ
g·mL
-1
范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系
,
相关系数(
r
)分别为
0.9996
和
0.9995
;
HPLC
测定当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷的含量稳定可行,简便,可作为当归四逆汤的质量控制标准。当归四逆汤合煎可提高有效成分的溶出。
当归四逆
汤
来源《
伤寒论
》,由
当归
、
桂枝
、
芍药
、
细辛
、
通草
、
大枣
、
炙甘草
组成。
主治
血虚寒厥证,手足厥寒,或腰、股、腿、足、肩臂疼痛,口不渴,舌淡苔白,脉沉细或细而欲绝。
阿魏酸为该方当归的有效成分,也是
当归四逆
汤
的重要成分之一,具有明显扩张冠状动脉血管、增加冠脉流量、抑制
ADP
诱导的血小板凝聚,增强细胞吞噬功能的作用。
芍药苷具有显著的镇痛、镇静、抗惊厥作用、扩张血管作用、保护脑缺血的作用解痉解热作用等也具抗菌、抗病毒和抗真菌作用。本
文利用
HPLC
法,对
当归四逆
汤
合煎液与单煎合并液中阿魏酸和芍药苷含量进行比较,从而从一个侧面探讨
当归四逆
汤
配伍的科学性。
材料与方法
1
仪器和试药
1.1
仪器:高效
液相色谱仪
(安捷伦);
HS3120
超声仪;
SZ-97A
自动三重蒸馏水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)
;分析天平(
TG-328A
,上海天平仪器厂);
CS66-2
电热恒温干燥箱(长沙医疗器械厂);高速离心机(
XYJ-2
,江苏医疗仪器厂)等。
1.2
试药:当归
、
桂枝
、
芍药
、
细辛
、
通草
、
大枣
、
炙甘草购自药店,经鉴定符合
2010
版药典。经去离子水漂洗(洗去浮尘与污物),于干燥箱中
60
℃
干燥,按复方规定比例称量各单味药混匀,粉碎,置干燥器中备用。阿魏酸和芍药苷对照品购自中国药品生物制品检定所。甲醇,乙腈,磷酸均为色谱纯,实验用水为三重蒸馏水
2
试验方法
2.1
色谱条件
色谱柱为
YWG—C
18
柱(
4.6mm
×250mm
,
10μm
),柱温为
30
℃
,流速为
1.0
mL·min
-1
,测定波长为
230nm
。进样量为
20μL
。分析阿魏酸流动相为:水:乙腈
=83
:
17
,芍药苷:
0.01%(v/v)
磷酸水溶液
:
乙腈
=95
:
5
。
2.2
溶液制备
2.2.1
对照品储备溶液的制备
精密称取阿魏酸,芍药苷适量,前者加甲醇配成
135.0μg/ml
阿魏酸对照品储备溶液备用,后者加热水配成
25.8μg/ml
芍药苷对照品储备溶液备用。
2.2.2
样品溶液制备
精密称取当归
、
桂枝
、
芍药
、
细辛
、
通草
、
大枣
、
炙甘草,以及复方药材粉末各
3
份,放在
25ml
比色管中,分别加入
20mL
蒸馏水,浸泡
30min
,沸水浴
30min
。静置分离,吸取上清液,在残渣中加入
15mL
水,沸水浴
20min
,静置取上清液,再次在残渣中各加入
10mL
水,沸水浴
15min
,静置提取上清液。合并三次提取液,定容至
50mL
容量瓶中,即得
当归四逆
汤
合煎液样品及各单味药样品。精密量取配方量的当归
、
桂枝
、
芍药
、
细辛
、
通草
、
大枣
、
炙甘草于
10mL
量瓶中,即得单煎合并液样品。将合煎液与单煎合并液样品经微孔滤膜(
0.45μm
)过滤,取续滤液即得样品溶液。
2.2.3
标准曲线的制备
用刻度吸管精密吸取
0.10,0.25,0.50,1.0,2.0mL “2.1.1”
项下的阿魏酸和芍药苷对照品储备溶液
,分别置于
4mL
量瓶中,稀释至刻度,摇匀。进样
20μL
,应用
HPLC
方法进行测定。以峰面积为纵坐标,对照品浓度为横坐标绘制标准曲线。
3
方法学考察
3.1
精密度试验
取同一阿魏酸和芍药苷对照品溶液各
20
μ
L
,分别连续进样
6
次,计算阿魏酸,芍药苷峰面积
RSD
。
3.2
稳定性试验
取同一当归四逆汤合煎液样品溶液,分别于
0
,
2
,
4
,
6
,
8
,
12
测定,计算阿魏酸,芍药苷峰面积
RSD
。
3.3
重复性试验
按
“2.2.2”
项下方法制备
3
份合煎液样品溶液分别按测定条件进样,计算阿魏酸,芍药苷峰面积
RSD
。
3.4
回收率实验
精密吸取复方
2
#
样品溶液
1mL
,加入
2
#
阿魏酸对照品溶液
1.4mL
,进样
20
μ
L
,依法测定计算阿魏酸回收率。精密吸取复方
3
#
样品溶液
1mL
,加入
1
#
芍药苷对照品溶液
0.15mL
,进样
20
μ
L
,依法测定计算芍药苷回收率。
4
样品含量测定
取
“2.2.2”
项下制备的样品溶液,按
3
项下条件进行测定,根据
2
个成分的线性回归方程,对当归四逆汤合煎液与单煎合并液中的成分含量进行计算。
结
果
1.HPLC
色谱图见图
1-6
。阿魏酸,芍药苷标准曲线见图
7
,图
8
。阿魏酸标准曲线方程为
A
=29.581
C
-0.5973
(
C
:μg •mL
-1
)
,
r
=0.9996
。芍药苷标准曲线方程为
A
=28.663
C
-12.297
(
C
:μg •mL
-1
)
,
r
=0.9995
。
2.
当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷精密度测定结果见表
1
,表
2
。从表
1
可知,实验结果峰面积平均值为
640.8 mv.s
,
RSD
为
4.3%
,表明实验精密度良好;从表
2
可知,实验结果平均值为
743.0mv.s
,
RSD
为
1.5%
,表明实验精密度良好。
3.
当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷稳定性测定结果峰面积
RSD
分别为
7.0%
,
3.1%
,表明实验稳定性良好。
4.
当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷重复性试验测定结果见表
3
,表
4
。从表
3
可知,实验结果阿魏酸峰面积平均值为
195.5mv.s
,
RSD
为
2.4%
,表明实验重复性较好;从表
4
可知,实验结果芍药苷峰面积平均值为
99.9 mv.s
,
RSD
为
3.0%
,表明实验重复性较好。
5.
当归四逆汤中阿魏酸,芍药苷回收率测定结果见表
5
,表
6
。
表
5
结果表明,阿魏酸平均回收率为
102.1%
,
RSD
为
3.3%
,方法不存在系统
误差,符合实验要求。表
6
结果表明,芍药苷平均回收率为
107.5%
,
RSD
为
5.4%
,方法不存在系统误差,符合实验要求。
6.
当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷含量测定结果见表
7
,表
8
。从表
7
中可以得到当归四逆汤合煎液中阿魏酸平均含量为
0.88mg/g
,
RSD
为
1.7%
;单煎合并液阿魏酸平均含量为
0.55mg/g
,
RSD
为
1.0%
,说明当归四逆汤合煎液中阿魏酸含量高于单煎合并液。从表
8
中可以得到当归四逆汤合煎液中芍药苷平均含量为
0.40 mg/g
,
RSD
为
1.5%
;单煎合并液芍药苷平均含量为
0.36 mg/g
,
RSD
为
1.6%
,说明当归四逆汤合煎液中芍药苷含量高于单煎合并液。
附图:
图8芍药苷的标准曲线
附表
讨
论
1
由表
1
,
2
的结果可以看出,阿魏酸和芍药苷的精密度良好,表
3
,
4
表明阿魏酸和芍药苷稳定性较好,而表
5
,
6
表明阿魏酸和芍药苷重复性较好。表
7
,
8
表明
方法不存在系统误差,符合实验要求。
2
由表
9
,
10
的结果可以看出,阿魏酸和芍药苷在当归四逆汤合煎液中的含量要高与单煎合并液。阿魏酸和芍药苷为当归四逆汤有效成分,故从本研究的结果可以得出,在当归四逆汤药味合煎的过程中,可以显著增加有效成分的溶出,从而保证用药的疗效,也说明了当归四逆汤方中诸药配伍的科学性。
3
该方法简单快捷,结果可靠,可作为当归四逆汤
质量控制的方法。同时,本研究也为进一步探讨该方的药理学和药代动力学提供了试验基础,具有重要意义。
4
本实验用水为溶剂提取当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷,具有溶剂无毒、廉价的优点。
5
本实验通过
HPLC
法,研究了当归四逆汤合煎液与单煎合并液中阿魏酸
和
芍药苷
的含量,方法简便快速,重复性好,测定结果准确,可作为该方的临床应用提供参考,得出合煎液中阿魏酸和
芍药苷
含量均高于单煎合并液,证明中药配伍的合理性。
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