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高效液相色谱法检测食品中八种合成色素

dzyzyk2010

2014/08/10

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摘要：建立了高效液相色谱法同时测定食品中8种着色剂的分析方法，此法大大提高了色素亮蓝的响应值，同时也增大了柠檬黄与新红的分离度，通过优化前处理、固相萃取条件及洗脱条件，有效除去杂质的同时获得较高的回收率。样品的加标回收率均在87.73%~96.20%，8种色素的线性关系良好，相关系数在0.9996~0.9999，试验用于食品中多种着色剂的同时检测，很好的满足食品检验机构样品数量大的要求。

关键词：高效液相色谱法；食品；合成着色剂；检测

合成色素作为一种人工合成的色素，广泛应用于食品生产加工中，因其色泽鲜艳，着色力强，色调多样，但是合成色素的毒性(包括毒性、致泻性和致癌性)也是不容置疑的。英国南安普顿大学研究人员发现，很多食品含有的着色剂，能够引起儿童多动症的症状，比如过度活跃、注意力不集中等，而这些有毒有害的物质在儿童食品中出现的频率及含量往往更高^[1]。因此GB2760-2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对合成色素的使用范围有着严格的控制。新红、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红都是常见的合成色素在使用，目前，食品中合成色素检验的国家标准中^[2]，实验过程中一般会出现新红、柠檬黄分离差甚至分不开的情况，以及前处理过程中操作繁琐的问题。目前食品检测部门工作量大，任务繁重，本文针对色谱条件及前处理做出一些改进，使柠檬黄与新红分离完全，同时简化了前处理过程，提高了工作效率，并且回收率高，测定结果令人满意。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

日本岛津高效液相色谱仪（配有自动进样器）；可见紫外检测器SPD-20A

甲醇（HPLC级）、氨水、屈臣氏超纯水

乙酸铵溶液：称取1.54g乙酸铵，加水溶解，转移到1000mL容量瓶中，定容至刻度，用酸度计调节pH为4.0，用0.45µm滤膜过滤。

胭脂红标准品浓度0.500 mg/mL、日落黄标准品浓度0.500 mg/mL、亮蓝标准品浓度0.500 mg/mL、柠檬黄标准品浓度0.500 mg/mL、苋菜红标准品浓度0.500 mg/mL五种标准物质，购自中国计量科学研究院。

靛蓝标准品纯度95%，购自农业部环境保护科研监测所，不确定度为1%。

赤藓红标准品纯度91.7%，购自Certificate of Analysis，不确定度为±2.0%。

新红标准品纯度92.0%，购自Certificate of Analysis，不确定度为±2.0%。

1.2固相萃取柱

前处理所用固相萃取柱：Welchrom^® P-WAX（60mg/3mL）（上海月旭提供；货号：WSP050306）用时先经3mL甲醇，3mL水活化平衡，然后上样。

1.3色谱条件

色谱柱：C18柱：5µm，4.6mm*250mm；月旭Welchrom （货号：00310-02043；序列号：w13211570）

流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10µL；检测波长：新红、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、赤藓红254nm; 亮蓝：595nm；流动相：0.02mol/L乙酸铵-甲醇，洗脱梯度见表1。

1.5标准溶液的配制

分别准确称取靛蓝标准品0.0526g，赤藓红标准品0.0545g，新红标准品0.0543g，用超纯水溶解各定容至100mL容量瓶，分别配制成溶液浓度为0.500 mg/mL的标准溶液。将新红、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红的标准溶液配制成50.0µg/mL的混标，精确吸取混标分别配成1.00,5.00,10.00,30.00,50.00µg/mL的混合标准溶液系列。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

方法采用0.02mol/L乙酸铵-甲醇为流动相，利用梯度洗脱分离，按GB/T5009.35-2003中测定开始时甲醇20%~35%梯度变化洗脱，容易造成新红和柠檬黄分离不完全甚至分不开，容易造成误判。本方法采用0.02mol/L乙酸铵-甲醇为流动相，利用梯度洗脱的方法提高分离效果。测试开始时流动相0.02mol/L乙酸铵-甲醇比例90:10维持10min，10min到15min将两者的比例调整为65:35,15min到22min两者比例2:98,22min到25min比例调整为80:20,25min到28min调整回开始的比例90:10，通过六步洗脱，可以较好的分离八种色素，尤其是新红和柠檬黄的分离。

2.2 检测波长的选择

针对在254nm波长检测，亮蓝灵敏度比较低的情况，本方法采用多波长同时检测，新红、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、赤藓红在254nm下检测，检测亮蓝采用595nm波长^[3]。

2.3 固相萃取柱的选择

固相萃取柱是利用固体吸附剂将样品中的目标化合物吸附，使目标化合物与基体干扰物分离，再用洗脱液淋洗达到分离和富集的目的。市场上大多数传统的固相萃取吸附剂都是大同小异，往往会导致分析物回收率低、净化不完全和重现性差。通过市售几种固相萃取柱试验比较，发现Welchrom® P-WAX（60mg/3mL）（上海月旭提供；货号：WSP050306）固相萃取柱能有效的满足实验要求，Welchrom® P-WAX（60mg/3mL）其吸附剂使用创新的聚合物技术，聚合物基质弱阴离子交换SPE吸附剂，具有弱阴离子交换和非极性疏水双重作用的混合吸附剂,含弱碱性的胺基功能基团，适用于从碱性或中性物质中分离纯化酸性物质，二氨基官能团对带电酸性化合物具有较高的选择性，从而提高灵敏度和方法的重现性。

2.4 方法的标准曲线及线性范围

新红、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红八种色素混合标准系列，在设定的色谱条件下进行色谱分析，根据保留时间定性，采用外标法以峰面积计算定量，以质量浓度（µg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。各种着色剂标准系列溶液的浓度与色谱峰面积线性相关，线性范围、线性回归方程（y为峰面积；x为浓度）相关系数及检出限见表2，结果表明各组分在1.00~50.00µg/mL的浓度范围内线性关系良好，8种合成色素色谱图见图1。

方法的重现性好。

2.5方法回收率及精密度

选用不含任何色素的碳酸饮料、米酒及面包作为基质，向其添加色素混合标准溶液，按相应前处理方法及色谱条件对三份加标样品进行加标回收试验分析，回收率及精密度结果见表3，由表3可知，测得结果的相对标准差在0.44~1.57%，样品中目标组分的回收率在87.73%~96.20%，符合国标规定的加标回收率在70%~95%的要求^[4]。

[4] 王朱天、杨大进、吴永宁等，食品卫生检验方法（理化部分）：注解（下）〔M〕.北京：中国标准出版社，2008.

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