6种AOBO粗提物抑制NO释放活性及抗肿瘤活性测定

zhenglong1

2014/12/31

私聊

中药/天然药检测

6种AOBO粗提物NO释放活性及抗肿瘤活性测定

某中药AOBO，多以果实入药，现代药理学显示该药具有抗菌，抗炎、镇痛作用，而且具有抗肿瘤及心血管系统方面等新的活性，具有较高的研究价值和开发前景。

本实验为了阐明其活性部位与活性成分，对其乙醇总提取物和不同极性的有效部位进行抗炎活性筛选；对分离到的几类单体进行了抗肿瘤活性的初步筛选。

生物体中NO由NO合成酶(NOS)来调控产生，目前为止已经确定了3种同工酶，分别为神经型NOS(nNOS)，血管内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)。通常状态下，人体中nNOS和eNOS都是在正常生理条件下调控NO的释放而起到正常的生理作用。iNOS的表达与炎症和癌症反应有密切的关联。由iNOS诱发的NO释放过多，会非选择性的对细胞组织造成损伤，引起局部的炎症反应。近年的研究表明，NO与癌症及癌症组织的增生也有关系。高浓度的NO还会损伤正常细胞的DNA合成，能够诱导细胞变异。今后iNOS选择性阻碍剂在抗炎抗肿瘤药剂的开发中被给予厚望。

1、抑制NO释放活性

实验材料和仪器

RAW2647细胞，Ham，sF12培养基，INF-r,LPS,MTT;Griess试药。

酶连免疫检测仪

样品

均由实验室自制，1号为AOBO95%乙醇提取浸膏，2号为石油醚萃取浸膏，3号为氯仿萃取浸膏，4号为乙酸乙脂萃取浸膏，5号为正丁醇萃取浸膏，6号为水层萃取浸膏。

试验方法

用含10%FBS的Ham，sF12培养液配制RAW2467细胞悬液，浓度为1.2x106/mL，每孔200uL接种于96孔培养板(含2.4xl05个细胞)，5%CO2，37度培养2小时，加入LPS(10ug/mL)，IFN-r(33ng/mL)2uL，100ug/mL样品DMSO溶液0.4uL，培养16小时。LPS终浓度100ng/mL，INF-r终浓度为100n留mL，溶解样品的DMSO相对于培养基的含量为0.2%。取上清液100ng/mL，加入事先调好的GriesS试药，用酶联免疫检测仪在570nm(对照655nm)测定吸光度。细胞生存率用MTT法进行测定。

试验结果与讨论

对6种AOBO的粗提物样品进行了一氧化氮(NO)产生抑制活性的测定，结果见下图：

从图中可以看出，95%乙醇总提物和石油醚萃取物表现出了较强的NO产生抑制活性(NO产生抑制率高于80%);95%乙醇总提物表现出较强的细胞毒性(细胞生存率为20%)，石油醚部分细胞毒性很小(生存率高于90%)。另外，氯仿萃取部分也显示了一定的NO产生抑制活性，几乎没有细胞毒性;乙酸乙脂浸膏、正丁醇浸膏和水层浸膏的NO产生抑制活性不明显，也没有细胞毒性。

2.、、抗肿瘤活性测试

药品、试剂和材料

培养液RPM1-1640(GIBCO)，小牛血清，青霉素和链霉素，胰酶消化液，DMSO溶剂，实验用HCT-8人结肠癌细胞，Bel-7402人肝癌细胞，BGC-823人胃癌细胞，A549人肺腺癌细胞，A2780人卵巢癌细胞。

样品为AOBO粗提物

实验方法(MTT法)：

将细胞培养在含10%小牛血清的即RP -Ml640培养基中，内含青霉素 100U/m1，

链霉素100ug/ml，于37℃，5%CO2培养箱中传代培养。

0.3%胰酶0.6ml消化贴壁的肿瘤细胞，含10%小牛血清的RPMl-64O培养液配制细胞悬液，浓度为1×104细胞/ml。于96孔培养板内每孔接种100ul(含1000个肿瘤细胞)，37℃培养24小时。给药组加入含有不同药物，每药设3个剂量组，分别为0.1ug/ml，lug/ml，10ug/ml，每组设三个平行孔，每孔加药100ul。对照组加入与药等体积的溶剂。置37℃，5%CO2温箱中培养4天后弃去培养液，每孔加入200ul 0.2%MTT溶液( RP -MI1640配制)。37℃孵育4小时，弃去上清，每孔加入 DMSO200ul溶解Formazan颗粒，轻度振荡后，用酶标仪，在参考波长450nm、检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)。

结果计算:以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，求药物对肿瘤细胞的抑制率。

以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出药

物的半数抑制浓度(IC50，ug/ml)

一般认为供试化合物在1ug/m1以下时，表明此化合物对该细胞有非常显著

的抑制作用;在1-10以上时，表明此化合物对该细胞具有一定的抑制作用;若在10

以上，则认为该化合物对该细胞抑制作用不明显。

从表中结果可知，1和2对人卵巢癌细胞有较强的抑制作用，对人结肠癌细胞，肝癌细胞，胃癌细胞，也有一定的抑制作用。另外的4组粗提物未显示明显的抗肿瘤活性

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