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装填色谱柱的小伙伴儿们看过来啦！详细过程讲解！

又又1990

2015/05/06

私聊

凝胶色谱（GPC）

小伙伴儿们，你的色谱柱装填过程顺利吗？现在给你分享层析柱的详细装填过程啦！以TOYOPEARL和TSK-GEL 5PW大孔树脂型填料为例哦！感兴趣的小伙伴可以作为参考！
1、装填前的准备
（1）TOYOPEARL和TSK-GEL 5PW装填的一般考虑 TOYOPEARL的装填压力最0.5~3bar（7~45psi）；TSK-GEL 5PW的装填压力最好为3~10bar（45~140psi）。尽管TOYOPEARL和TSK-GEL 5PW填料也可以通过重力沉降法进行装填，但这并不值得提倡。TOYOPEARL的装填压力不应过高（<5bar），TSK-GEL 5PW的装填压力不应超过20 bar。
成功装填TOYOPEARL和TSK-GEL 5PW所需要的设备有（参照图1）：泵、HPLC或蠕动泵、压力表、水平仪、玻璃/聚丙烯酸/PEEK或不锈钢层析柱、储槽（可选）等。

图1 装填所需要的装置

（2）小颗粒的去除（建议最好去除小颗粒）
在匀浆后的胶体中所存在的小颗粒会阻塞筛板或烧结板，最终会导致整个柱子的压降增大。通过下列过程可将匀浆后胶体中所存在的小颗粒去除。
a，通过一根搅拌棒或桨激烈搅拌包装容器内的树脂填料将其搅拌成悬浮液，请不要使用磁力搅拌器，这会磨碎树脂填料并产生小颗粒。一旦成为悬浮液后，立刻将需要量的悬浮液，大概4体积的悬浮液=3体积的树脂填料，倒入某个容器内，容器的体积应不小于需要装柱填料体积的4倍。加入蒸馏水或者缓冲液至4倍填料体积，并一直保持搅拌。

b，静置匀浆液，静置时间取决于容器的直径、匀浆溶剂和填料的粒径大小。TOYOPEARL和TSK-GEL 5PW填料用水匀浆时，平均静置时间如下：

c，一旦填料静置完成后，小心倒出表面的悬浮液。

图2 倒出表面的悬浮液

d，加入3倍填料体积的蒸馏水或者缓冲液，轻轻在填料表面搅拌使其重新悬浮。请不要使用磁力搅拌器，这会磨碎树脂填料并产生小颗粒。

图3 再次悬浮

e，重复步骤c和步骤d至少3次以上，直到悬浮液不再浑浊。
在去除小颗粒时的最后一次步骤中可加入装填缓冲液，参见（3）缓冲液平衡，进行填料的平衡，如此可节约时间。
（3）缓冲液平衡
对于所有的TOYOPEARL和TSK-GEL树脂填料，建议装填时使用高离子强度的缓冲溶液。尽管这些填料可以用水装填，但相对于用同样装填方法而使用盐溶液作为缓冲液的层析柱而言，塔板数较低并且不对称性因子较高。
对于疏水层析柱用水装填时，相对于高离子强度的缓冲溶液更容易在柱内壁形成沟槽。这些沟槽的存在非但不是必须的，更会对柱子的性能造成不良影响。当选择装填缓冲液时，最好根据经验来选择，因为根据您特定的应用而选择最优化的填装缓冲液是最为合适的。总的来说，分离纯化步骤，包括清洗和消毒步骤中将使用到的最高离子强度的流动相，是装填缓冲液的首选。一些常见的装填缓冲液请参见下表。

（4）匀浆准备
填料中的小颗粒被去除后，需要进行匀浆液浓度的调节。匀浆液的浓度等于静置胶体积除以匀浆后的总体积。其调节按如下步骤进行：
a，均匀搅拌上述步骤所得、已去除小颗粒的填料浆液，并将其倒入一个预先准备的量筒。

图4 静置中的填料浆液

b，将浆液静置过夜（>12小时），以便获得最佳装填效果。
c，对于TOYOPEARL树脂填料，确定静置胶体积后，加入或去除装柱缓冲液，以便将匀浆液浓度调节至30~50%；对于TSK-GEL 5PW树脂填料，最常用的匀浆液浓度范围为25~70%，并且当匀浆液浓度在40~50%的范围内时效果最佳。
d，对于装填一根给定的空柱，可按下表中所推荐的内容确定装柱所需的静置胶体积。

可供选择的匀浆准备方法：
——均匀搅拌上述（3）中步骤所得、已去除小颗粒的填料浆液，并将其倒入一个预先准备的布氏漏斗或类似容器中。
——使用水泵进行抽滤，直至匀浆液成为一块湿滤饼（所有剩余的溶剂被去除）。
——称取填料滤饼的大概重量（1g湿滤饼约为1mL静置胶体）并使用上表确定装柱用胶量。
——将滤饼转移至一个大口杯中，加入足够量的装柱缓冲液，调节匀浆液浓度至30~50%。
2、装填步骤
TOYOPEARL填料的装填及操作流速：

*并不是所有类型的填料均具有各种规格等级.
TSK-GEL 5PW树脂填料的装填及操作流速：

恒流速/半恒压装填法（最常用）
a，如果使用储槽/罐，请将其装于层析柱上。柱子及储槽的总容积必须确保足够将匀浆液一次性注入。 
b，将柱底筛板用装填缓冲液润湿，并将缓冲液放空一部分以便赶走所有的气泡。关闭柱出口，并在柱底部留出1~2cm高的缓冲液。

图5 柱底筛板的浸润等

c，再次将浆液搅拌均匀，以确保填料的均一。
d，小心将匀浆液倒入层析柱中并注意避免倒入时产生气泡。
e，将匀浆液倒入后用喷壶清洗层析柱的内壁。
f，立即将进样分配器放置于匀浆液表面。注意在分配器与溶液间不应有气泡存在。
g，打开层析柱出口开启泵。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱。
h，缓慢增加至最终流速，这可以避免液压对于所形成的柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。流速可以阶段性地增大，增加量取决于层析柱的柱尺寸和目标流速。下表列举了部分例子。

i，当柱床最终形成后关闭泵并关闭层析柱出口。
j，装填中，如需要使用储槽/罐时，应保证柱床形成于层析柱的低端部分。使用吸液管或泵，利用虹吸原理将储槽/罐中的悬浮液吸除。最后，移走上层的储槽/罐以及配套的密封圈。
k，小心将进样分配器置于柱中，离柱床约2~3cm，同时避免将空气带入层析柱中。
l，确保分配器就位后，参照步骤h开启泵，并同时将层析柱的出口打开。
m，柱床将进一步被压缩。当压缩完成并且压力稳定后停泵并关闭层析柱出口。
n，小心松开分配器密封圈，小心将分配器降至柱床表面。在移动分配器时，一定注意不要扰动柱床。最终，分配器应直接接触柱床。
o，重复步骤i~n，直到柱床无法被进一步压缩。最终，柱床与分配器间的距离应小于0.5cm。这可能需要重复上述步骤2~3次，直到柱床稳定。
p，层析柱装填完毕后，准备进行柱效的评价。

分
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