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某药物合成分析方法开发实例

浪淘沙隐

2015/08/31

化学药检测

最近我新接到的某新项目，项目为某新药。为配合合成进行新药工艺研发，需要开发分析方法进行研究。因为某些原因，分析接到这个项目时，合成已经打通工艺路线，并得到了最终产品——原料药D和其中两个工艺杂质。因此，从原料药D开始开发方法。以下是合成反应路线、分子结构式和分析方法开发过程。
一、反应路线和分子结构式：

其中R1为含有双键和N元素的杂环

R2为带有数个苯环和其他基团的基团
二、分析以上工艺路线和分子结构，整理思路，确定初步的色谱条件。
1. 反应路线中，除SM2外，其余各个杂质均带有苯环和其他一些双键，具有较强的紫外吸收，可以利用HPLC分析。其中SM2虽然只有1个双键，但是含有Br这个助色团，可以尝试与其他物质一起分析。
2. 以上各物质，SM2及中间体B不带有明显的酸碱基团，并且极性适中；其余各物质虽然或者带有氨基，或者带有羧基，但都不是连接在直链上的，因此其极性和酸碱性应该也不会太大。因此选用普通的C18柱分析，此次选用agilent SB-C18 250*4.6mm 5um；流动相方面，尝试10mM KH₂PO₄(pH3.0)-乙腈体系，梯度洗脱。初始梯度采用较为快的梯度，以减少分析时间，增加效率。

时间（min） A% B%
0 80 20
15 20 80
23 20 80
23.1 80 20
30 80 20

3. 以上各物质，极性相差不大，可以尝试使用同一个方法分析起始原料SM1、中间体A、B和成品D。
4. 进样量为5ul，柱温为30℃，波长待定。
5. 以上各物质极性适中，应该能溶于甲醇，D浓度初步定为1mg/ml；并配制含D 1mg/ml及各杂质0.01mg/ml（1%）的混合溶液，考察分离情况。
三、试验过程及色谱图
1. 配制样品时发现，A-ZZ1不溶于甲醇、乙腈和水。通过试验发现，其溶于碱性溶液，因此配制pH8.0的磷酸盐溶液，超声溶清。以后可能得关注这个情况。
2. 混合溶液色谱图（一张全景图，一张放大图）：

SM1定位图：

SM2定位图：

A定位图：

LS-A定位图：

A-ZZ1定位图：

B定位图：

B-ZZ3定位图：

四、结果分析及优化思路。
1. SM2即使在214nm下，其响应仍然太小，不适合与其他物质一起分析，需要单独开发方法分析；其余各物质峰均过载，分析其纯度应该降低浓度至0.5mg/ml。
2. 各物质保留适中；D和LS-A未能分离，其余各物质分离度均符合要求。
3. 混合溶液前后相隔5小时进样，色谱图能完全重合，证明溶液在5小时内稳定。
4. 混合溶液及单针定位溶液色谱图表明，含有羧基的化合物在这个方法中峰形都比较差，其余均为对称峰。分析认为应该是流动相pH在这些化合物pKa±2范围内，导致峰形差。根据经验，这些酸性物质，其pKa应该在4-5之间，因此可以尝试降低流动相pH至2附近，或增加至6-8。本次优先尝试pH2的流动相。
五、优化后色谱图
1. 0.1%磷酸体系色谱图

2.. 0.1%TFA体系色谱图：

六、优化后结果分析
1. 0.1%磷酸溶液pH值大约为2.4，相比pH3.0的磷酸盐体系，更为远离这些酸性物质的pKa，因此峰形得到改善，但还未得到完美的峰形。
2. 0.1%TFA溶液pH大约为1.9-2.0间，其应该在这些酸性物质的pKa±2之外，因此得到了对称、尖锐的峰形。
3. 0.1%TFA体系下，LS-A和D间分离度符合要求（大于2），其余各物质间分离度仍符合要求。
4. DAD扫描紫外光谱图显示，各物质（除SM2外）均在215-230nm处有较大吸收，因为使用了TFA，因此选用230nm作为方法的波长。在230nm下，梯度洗脱时，基线漂移量为25mAu，尚可接受。
5. 各物质纯度分析样品浓度最终确定为0.3mg/ml，确定过程就不赘述了。
七、结论：
目前方法中，峰形良好，分离度符合要求，保留及分析时间适中，可以作为该项目的分析方法。但仍存在一些可以优化的地方，比如仍有很多杂质没有制备，这个方法分离度仍然不够保证能分离新加入的杂质；另外，分析其中的中间体和起始原料，主峰与相邻峰分离度并不完美。但新杂质没有得到，也没有必要过度优化；又比如，这个方法开发过程中，并没有使用较高pH进行试验，并不清楚较高pH条件下的出峰情况，不能对这个方法有比较全面的了解。因此，暂时使用以上优化后的方法分析合成提供的样品，日后如有需要再进行研究。
七、与众版友的讨论
1、峰形、分离度和保留情况是一个色谱分析方法的三大要素，其中峰形为最优先要解决的问题，峰形不能解决，那么分离度或方法精密度就不能保证；峰形解决了，那么分离度就要着重解决。而保留情况通常可以根据需要放宽要求。
2、方法开发需要理论联系实际，多观察色谱图，发现问题，再根据理论和经验解决问题。解决问题时，不应一次改变多个条件，否则就不能准确判断影响色谱行为的因素。
3、以上这个例子，仅仅只有调整峰形的步骤，分离度峰形调整好后分离度也就差不多好了。虽然简单，但是对于新手来说，仍然可以参考一下，了解方法开发的思路。日后这项目有进展，我也会再补充。
5、以上方法开发时，我也是走了一些弯路的，也有没有总结到的东西，各位版友可以指出，讨论讨论，共同进步。

精
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分
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浪淘沙隐

第1楼2015/08/31

图片没设置好，各位将就看下。

0

小鱼625

第2楼2015/08/31

分析思路很好，楼主开发研发能力很强啊。那个全景图，有一个峰特别高，其他的都相对很低，可以调试下浓度，让峰型更美观些否？

0

浪淘沙隐

第3楼2015/09/01

不敢说强，论坛估计有很多比我强的。我这个混合溶液的杂质是按1%的浓度配制的，目的是考察出峰情况，保证能清晰的辨认出峰情况，很多系统适用性也是按照这个浓度来考察的，所以不好调浓度。其实这里我上文也提到了，1mg/ml的溶液，主成分是过载的，根据实验，最后把主成分浓度降低到了0.3mg/ml，那么杂质浓度相应的也会降低到约为以前的1/3。
小鱼625(v2974654) 发表:分析思路很好，楼主开发研发能力很强啊。那个全景图，有一个峰特别高，其他的都相对很低，可以调试下浓度，让峰型更美观些否？

0

wyong5053132

第4楼2015/09/01

很好的学习资料！

0

浪淘沙隐

第5楼2015/09/06

其实这个例子里，我是走了一些弯路的。比如进第一针，峰形不好，那么这时候是没必要进行单针定位的，根据主峰的峰形和分子结构就可以判断，直接换流动相调整好峰形再定位就可以了；另外0.1%磷酸体系是可以不试验的，因为0.1%磷酸pH大概是2.4，与pH3.0的流动相相比变化不大（当然试验一下也是可以的，毕竟这个方法波长比较低，如果能用磷酸，那么基线漂移就会好点）。
wyong5053132(wyong5053132) 发表:很好的学习资料！

1

trees83

第6楼2015/09/21

受教了！很感谢！

0

Insm_b97c118a

第7楼2022/01/01

你好，我想问一下你这里面说的峰过载是怎么判断的

0

浪淘沙隐

第8楼2022/01/26

1、峰高超过1000就有可能过载；

2、峰平头或不够尖锐，基本上就是过载了；

3、降低浓度或减少进样量后，峰面积不呈线性了，差不多就是之前过载了。
Insm_b97c118a(Insm_b97c118a) 发表:你好，我想问一下你这里面说的峰过载是怎么判断的

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