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【仪器微课堂】第八期液质联用检测畜产品中兽药残留

ghsunmer

2016/12/27

液质联用（LCMS）

12月23日下午三点，【仪器微课堂】第八期 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]液质联用检测畜产品中兽药残留如期举行。
分享专家：徐水市农水畜禽产品质量检测中心高级兽医师端礼钦
分享形式：采用PPT图片+语音形式
参与人数：306
内容整理：ghsunmer
首先要感谢端老师来给版友们做分享，端老师现任徐州市农产品质检中心副书记。熟悉[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]LC-MS/MS、GC-MS/MS、GC、HPLC、AFS、AAS等大型检测仪器设备，熟悉食品农产品各类政策法规；仪器检测、微生物学检测等多种检测手段；计量认证，农产品检测机构考核等工作。
嘉宾分享环节：

本次分享将从以下几方面进行：

β-受体激动剂的简介：

以上是本次介绍的主要目标物质的结构式。本次分享就是以上面几种物质为例，把几种β-受体激动剂的类型都包含了。

如果食用了含有β-受体激动剂的肉类，人们将会有不同程度的反应，比如：面色潮红、头痛、胸闷、心悸、心慌、四肢麻木等，如果是对于本身就患有一些疾病的人来说，其反应将更加剧烈，甚至危及生命。
β-受体激动剂在养殖上的作用就是抑制脂肪合成，加快生长速度、增加瘦肉含量，可以提高10%瘦肉含量，这也就是我们常说的“瘦肉精”、β-兴奋剂，我国一直禁止使用的。

对于β-受体激动剂中毒的时间，最早是1990年在西班牙有一个家庭食用牛肝后“瘦肉精”中毒，我国最早是在香港于1998年发生了中毒事件，在2001年时发生一次最严重的中毒事件，大约有1000多人中毒。我国于1997年开始部分限制β-受体激动剂的使用，后来逐渐加入许多药品，禁止于所有畜产品使用。

目前对于β-受体激动剂的主要检测方法可以归纳为以上几类。
胶体金方法在养殖场与屠宰场使用较多，也就是常说的试纸条法；Elisa法因为有一定的假阳性率，所以现在使用的越来越少了；HPLC法使用不多，因其检出限与检测效果的问题没有被广泛使用；目前使用较多的后是两种，气质法早期经常被用来定性，现在使用较多的还是[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]液质联用法。
[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]液质联用法的检测原理是先酶解，用高氯酸调节pH，沉淀蛋白，异丙醇与乙酸乙酯体系提取，经过阳离子交换柱净化，内标法定量。

以上是国标方法的前处理步骤，首先酶解、提取然后净化、检测。

提取时要不断离心、调节pH值。

采用固相萃取方法进行净化，因为β-受体激动剂一类弱碱性物质，所以采用阳离子交换柱。固相萃取一般步骤：活化，过柱、洗涤柱子，最后是洗脱。最后溶解，过滤，测试。此法的耗时长、步骤多、运用的器皿多，调节pH的步骤多。因为步骤过于繁琐，所以为了提高回收率，减少偶然误差，采用内标法而非外标法进行实验。

下面为大家分享中国兽医药品监察所开发的方法，据我们使用，感觉效果较理想。也是我们省中心在全省推广的方法。
将提取剂调整，乙酸钠溶液对很多β-受体激动剂的提取效果不佳，而乙腈极性强而异丙醇极性较弱，所以就可以将体系中不同极性的物质都提取出来。
β-受体激动剂在动物体内也会发生油酸化反应与葡萄糖醛酸络合反应，所以大部分β-受体激动剂是以结合态形式存在。样品中的β-受体激动剂则会以游离与结合两种形式存在，而结合态的极性较强。用乙腈与异丙醇则可以把两种形式的都提取出来。
此外如果想提高萃取效果，则可以适当增加异丙醇/乙腈溶液的量。
然后是离心与氮吹，温度提高了，耗时较长，大约需要一小时左右。
之后是酶解，温度也有所提高，时间就减少，大约需要两小时，与国标相比节约了大量时间。

可以适当提高转速。一些脂肪含量较高的样品可以在酶解后加入正己烷去酯。
最后溶解液的体积增加了，方便进样。

以上是我单位的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]液质联用设备图与三重四级杆质谱原理图。

以上是国标方法的仪器条件与离子参数表。

以上是改良后的仪器条件与离子参数。我们单位采用的是超高效液相色谱，所以仪器条件略有不同。采用氘代内标进行实验，仅供大家参考。

上面是几种物质与其内标的总离子流图。

这是克伦特罗与内标的响应值。

这是莱克多巴胺的线性指标，大于999.

线性范围回收率等如上。线性范围可以扩展，回收率良好。重复性RSD<10%。关于回收率，因为内标响应值的差异，而且前处理步骤复杂，所以如果用外标法的回收率较低。外标法的沙丁胺醇的回收率较高也就是到达20%，莱克多巴胺可以到达60-70%，所以说对于β-受体激动剂不是完全不能用外标法，对于个别组分也是可以的，但是如果是做多组分的，建议还是采用内标法。

注意内标要与目标物的峰面积相匹配，否则需要稀释。

对于一些新的方法则要看大家的实际需求，常规的实验还是需要酶解的。也有些文献说酶解对络合态的β-受体激动剂效果较好，对于游离态的可能会损失回收。所以方法的选择要针对需求，如果是初筛，或者针对性较强的则可以考虑其存在形式来选择方法。对于方法选择推荐用阳性样品进行实验，因为加标回收的方法不能保证混合均匀与生物体反应，所以还是不能确定其效果如何。

提问解答环节：
问题一、
兽禽产品中β受体激动剂检测的前处理过程中，除了酶解之外，其他方法比如酸解，碱解等，效率如何？

其他方法大家可以尝试，因为我单位主要针对多组分残留，所以只有酶解适合。一些研究所可能研究较深入。
问题二、
内标怎么选择？兽药种类很多，药品极性差别大，每个兽药采用相应的内标，这样实验做的性价比极地，有没有什么通用的方法来选择内标，比如磺胺类奎诺酮类药选择一个内标即可？

首先要和被分析物的理化性质相近，试样中不存在，不发生反应，加入量应该接近于被测组分，在色谱上要与组分出峰时间相近，不可溢出。理论上选择一种就可以。
问题三、

我想问22286-2008这个方法如果不调酸碱直接过柱行不行呀？对结果有影响吗？还是主要是对仪器的损耗？

不建议直接做，对仪器还是有很大损耗，还是按照国标严格执行较好。
问题四、
国标上要求酶解后调pH至11.0，可是用酸度计指示的话容易污染样品。可否直接用pH试纸来指示。这个测试对pH的要求是否一定要那么精确？
可以采用精密pH试纸来调节，一般在±0.3的范围内都是可以的。

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weiqing1983

第1楼2016/12/27

应助达人

好帖子，支持！

0

vm88

第2楼2016/12/28

学到不少东西，谢谢端木老师。

0

zyl3367898

第3楼2016/12/28

应助达人

有不少经验，学习了。

0

lijing320323

第4楼2016/12/28

感谢楼主分享，好东西

0

东海710

第5楼2016/12/28

应助达人

总结的不错加油

0

mofeng2012

第6楼2018/05/30

您好！老师，对于瘦肉精前处理，标液怎么处理？若是标液不处理的话，标液中内标量和样品处理的内标物的量就不一样了，就会有损失，咋整？

0

hujiangtao

第7楼2018/05/30

应助达人

标液里也加内标，而加在样品里的内标和标准品同时损失，不影响定量的
mofeng2012(mofeng2012) 发表:您好！老师，对于瘦肉精前处理，标液怎么处理？若是标液不处理的话，标液中内标量和样品处理的内标物的量就不一样了，就会有损失，咋整？

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