液质联用检测烟酰胺含量的方法

dgby

2017/09/04

私聊

液质联用（LCMS）

1.试剂：
除特殊说明，所用试剂均为色谱纯，在分析中所用的水为一级水。
1.1 试剂：乙酸铵，甲酸，乙腈，冰醋酸，甲醇
1.2 对照品：烟酰胺（供含量测定用）
1.3安捷伦1260型高效液相-质谱仪（API3200）。
1.4超声波清洗器：KQ-500E型超声仪。
2.分析步骤
2.1 试样处理
2.1.1对照品溶液制备：精密称取烟酰胺对照品约10mg（精确至0.01mg），于50ml容量瓶中，加入0.1%甲酸水（含20%甲醇）制成每1ml约含0.2mg烟酰胺的对照品溶液，摇匀，经0.45μm的滤膜过滤，即得。

2.1.2 供试品溶液制备：取固体试样20粒（片）或10g（若试样为胶囊，应取内容物），研细，混合均匀，精密称取样品0.05g，于50ml容量瓶中，加入0.1%甲酸水（含20%甲醇）约70ml，35℃超声（功率500W，频率50kHz,）处理至提取完全（约25min），取出，放冷，定容，摇匀，离心，经0.45μm的滤膜过滤，即得。
2.2 色谱条件
2.2.1 色谱柱：以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂（柱长10cm，内径4.6mm，粒径3μm ）或同等性能的色谱柱
2.2.2 柱温：40℃
2.2.3 流速：0.4ml/min
2.2.4 流动相：水相（称取0.772g乙酸铵，加水1000ml溶解，用冰醋酸调PH值3.0）：乙腈=50:50
2.2.5 质谱条件：ESI⁺模式

Q1	Q3	Time(msec)	DP	EP	CE	CXP
121.101	80.10	500	46	11	37	4.0
121.101	71.90	500	46	11	37	4.0

121.1为母离子碎片，80.1为定量离子碎片，71.9为定性离子碎片。

CUR	CAD	IS	TEM	GS1	GS2
20	6	5500	650	55	55

时间： 3.5min
2.3 标准工作曲线绘制：
分别精密吸取烟酰胺储备液制成5个对照浓度；分别为0.0625μg/ml、0.123μg/ml、0.185μg/ml、0.265μg/ml、0.308μg/ml的工作标准液，经0.45μm的微孔滤膜过滤，进样量为10μl，以浓度C（mg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准工作曲线。
2.4 计算结果：
试样中的烟酰胺按以下公式计算：
X=C×V×100/M/1000
式中:
X—样品中烟酰胺含量，mg/100g；
M—样品的质量，g；
V—样品稀释的体积，ml；
C—样品中烟酰胺的浓度，μg/ml。
3. 方法学验证：
3.1 线性范围确认
3.1.1试验数据：

标准序号	浓度C（μg/ml）	烟酰胺峰面积(A)
STD1	0.0625	25100
STD2	0.123	49000
STD3	0.185	71100
STD4	0.265	105000
STD5	0.308	122000
线性方程	Y=3.9E+5X-65.342
相关系数(R2)	0.9993

3.1.2试验数据：
以浓度C（mg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准工作曲线，如下图。

3.1.3线性试验结论：
线性评价：相关系数 R²为0.9993,所以用该方法测定烟酰胺的含量，在浓度为0.0625μg/ml至0.308μg/ml之间呈现良好的线性。
3.2 检出限和定量限：
分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比（S/N）计算。DL定义为S/N=3时对应的待分析浓度，QL定义为S/N=10时对应的待分析浓度。
3.2.1检出限
用浓度为0.0008μg/ml的标准品溶液，测得信噪比分别为16，即取信噪比为（3:1）定方法的检测浓度为：DL=0.0015μg/ml,按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.0015μg/ml×100ml/0.1g=1.5μg/g。
3.2.2定量限
信噪比为（3:1）定方法的检测浓度为：DL=0.0015μg/ml，取信噪比为（10:1）定方法的检测浓度为：QL=0.005μg/ml,按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.005μg/ml×100ml/0.1g=5μg/g。
3.3精密度试验：
3.3.1试验方法：精密称取样品6份，按4.1试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD（%）。
3.3.2试验数据：（见下表）

样品名称	编号	M（g）	V(ml)	C(ug/ml)	X（mg/100g）	X平均	RSD（%）
营养强化配方粉	1	0.0522	50	0.221	21.169	20.98	2.8
	2	0.0536	50	0.217	20.243
	3	0.0514	50	0.216	21.012
	4	0.0506	50	0.222	21.937
	5	0.0507	50	0.213	21.006
	6	0.0531	50	0.218	20.527

3.3.3试验结论：6份样品含量的RSD（%）为：2.8%，其RSD（%）小于3.8%，表明该方法的重复性良好。
3.4 稳定性测定：
3.4.1试验方法：
将烟酰胺对照品溶液分别在室温下放置0 min、30 min、60 min、90min、180min、240min时，取4μL注入质谱仪，记录烟酰胺的峰面积，计算其RSD(%)。
3.4.2试验数据：

时间（min）	烟酰胺的峰面积
0	49600
30	47700
60	49400
90	48200
180	48300
240	49400
RSD（%）	1.7

3.4.3试验结论：
将烟酰胺对照品溶液分别在室温下放置0 min、30 min、60 min、90min、180min、240min时，RSD（%）为1.7%，表明烟酰胺对照品溶液在室温下4小时内的稳定性良好。
3.5空白方法对测定结果的影响
3.5.1试验方法：
取0.1%甲酸水（含20%甲醇）10μL注入色谱仪，与样品溶液的出峰时间对比。
3.5.2试验结果：
样品色谱图

空白溶剂色谱图

3.5.3试验结论
用空白方法处理的溶液在烟酰胺样品溶液的出峰时间处无吸收峰，表明空白方法对测定结果基本无干扰。
3.6回收率试验：
3.6.1试验方法：
对照品和样品的处理方法见精密度试验。
加标样品的处理：精密称取约0.1g样品9份，置于50ml棕色容量瓶中，分成3组，每组3份，于每一组中分别精密加入烟酰胺标准品（浓度为100.3μg/ml）2.0ml、3.5ml、11.0ml，加入0.1%甲酸水（含20%甲醇）适量，超声20min后取出定容至刻度，上清液经0.45μm滤膜过滤后，作为加标样品溶液；取该样品溶液和加标样品溶液各10ul进样。
3.6.2试验数据如下：【试验样品为：营养强化配方粉】

回收率试验结果表（色谱图见附图）

样品	样和加标（ug）	样品底值（ug）	实测加标量	理论加标量	回收率（%）	平均值（%）	RSD(%)
1	15.15	11.14	4.01	4.01	99.964	99.17	2.60
2	15.05	10.97	4.08	4.01	101.656
3	14.9	10.95	3.95	4.01	98.439
4	17.6	10.83	6.77	7.02	96.486
5	17.7	10.95	6.75	7.02	96.117
6	17.7	10.99	6.71	7.02	95.519
7	33.1	10.78	22.32	22.07	101.111
8	33.35	10.87	22.48	22.07	101.864
9	33.45	11.08	22.37	22.07	101.366