凯氏定氮法检测期间微生物负载情况研究
1凯氏定氮法检测前后产品中微生物负载情况研究
本部分主要是考察人血白蛋白原液蛋白质含量检测前后产品中微生物负载水平的变化情况。
1.1 材料
供试品：人血白蛋白原液蛋白质含量检测前后的制品；
培养基：青岛日水生物技术有限公司生产的胰酪大豆胨营养琼脂培养基（成品），批号：20150825。
30-35 ℃细菌培养箱；净化超净工作台；无菌试管等。
1. 2方法
（1）样品的采集
采用无菌的塑料试管，对连续生产的201601批至201610批共10批人血白蛋白产品原液蛋白质含量检测前后的制品进行取样，共得到20个样品。
（2）试验方法
根据《中国药典》2015版三部1105通则“微生物计数法”要求，在超净工作台下，每个样品取样1 ml接种到无菌的胰酪大豆胨琼脂培养基（φ脂培培养基）上，轻轻摇动，待样品分布均匀涂布后，放置于30-35 ℃细菌培养箱中培养3天，进行细菌计数。每个样品至少接种2个平皿，同时做阴性对照。
1.3实验结果
经30-35 ℃培养3天后，观察平皿培养结果，发现阴性对照无细菌菌落生长，人血白蛋白原液201601批至201610批细菌含量较多，菌落数均在100 cfu/ml以上，且部分平皿无法进行细菌菌落的准确计数。结果表明，人血白蛋白产品原液蛋白质含量检测前后制品中微生物含量存在批间差异，但总体来看微生物含量较多，且检测前后明显增多。图1至8为部分批次产品凯氏定氮法检测前后微生物的负载情况,图1,3,5,7为检测前，图2,4,6,8为检测后。
图1人血白蛋白201601批
图2人血白蛋白201602批
图3人血白蛋白201603批
图4人血白蛋白201605批
图5人血白蛋白201606批
图6人血白蛋白201608批
图7 人血白蛋白201609批
图8 人血白蛋白201610批
2产品中微生物负载量变化情况研究
本部分主要考察凯氏定氮法检测蛋白质含量期间，随时间的延长人血白蛋白原液中微生物负载量变化的情况。通过对比检测前后制品原液中微生物负载水平的变化情况，分析由于检测时间较长带来的微生物数量的变化情况。
2.1材料
2.1.1 试剂
供试品：人血白蛋白原液蛋白质含量检测前的制品；
培养基：青岛日水生物技术有限公司生产的胰酪大豆胨营养琼脂培养基（成品），批号：20150825。
2.1.2 仪器和软件
30-35 ℃细菌培养箱；净化超净工作台；无菌试管等。
2.2方法
2.2.1样品的采集
采用无菌的塑料试管，对连续生产的201601批至201603批共3批人血白蛋白产品原液蛋白质含量检测前的制品进行取样，每批样品至少取样20 ml。
2.2.2试验方法
根据《中国药典》2015版三部1105通则“微生物计数法”要求，将每批样品分样到13个无菌无热源的试管中，1 ml/管。放置于10-20 ℃的条件下密封保存，在超净工作台下分别把0 min、1 min、2 min、3 min、5 min、10 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h时的样品取0.1 ml接种到无菌的胰酪大豆胨琼脂培养基上，轻轻摇动，待样品分布均匀涂布后，放置于30-35 ℃细菌培养箱中培养3天，进行细菌计数。每个样品至少接种2个平皿，同时做阴性对照。
2.3 实验结果
经30-35 ℃培养3天后，观察平皿培养结果，发现阴性对照无细菌菌落生长，表1为人血白蛋白原液201601批至201603批样品不同时间段接种的平皿中菌落平均数，图9为201601批至201603批产品不同时间段微生物数量变化趋势。
表1 不同时间段接种的平皿中菌落平均数
图9 201601批至201603批产品不同时间段微生物数量变化趋势
从培养结果看，人血白蛋白原液201601批至201603批样品0 min、1 min、2 min、3 min、5 min、10 min、15 min、30 min，样品中的菌落数几乎没有变化；1 h后样品中菌落数有增长趋势。
本次试验结果表明，人血白蛋白产品原液在等待凯氏定氮法检测蛋白质含量期间，制品中微生物负载量有增长的趋势。根据试验结果推算，在2-3小时后每ml人血白蛋白原液中至少含100 CFU，那么批量1000L的制品中至少含有109 个微生物，如此数量的微生物肯定会对人血白蛋白的质量（如纯度、热源）有一定的影响。但具体使用凯氏定氮法检测人血白蛋白原液蛋白质含量前后产品质量指标（如纯度、热原质等）的变化情况还有待进一步研究。
结合近红外光谱检测技术快速检测（2-3分钟）的特点，如果在人血白蛋白实际生产中应用近红外光谱快速检测技术，除了能够快速准确的为人血白蛋白生产提供非常有意义的指导外，还能有效控制产品中的微生物负载量，大大降低人血白蛋白产品的质量风险。
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