磷钼钨酸-干酪素法测定中药注射剂中的鞣质
引言：鞣质( tannins) 亦称鞣酸、丹宁、丹宁酸，为多酚类化合物，在 70% 以上的中草药中广泛存在，其存在部位以树皮和虫瘿( galls) 中常见。鞣质可分为可水解鞣( hydrolysable tannins) 和缩合鞣质( condensed tannins)。鞣质是一类具有沉淀蛋白作用的水溶性多酚类化合物,约70%以上的中草药中含鞣质类化合物。它是由没食子酸(或其聚合物)的葡萄糖(及其它多元醇)酯、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及两者混合共同组成的植物多元酚。鞣质常作为杂质除去,因为在中药制剂中,鞣质除了会影响制剂的稳定性和澄明度外,还可能会引起一系列严重的生理反应。例如,某些鞣质注入体内会引起黄疸和肝坏死等一系列临床症状。近年来中药注射剂的安全性问题已引起人们的广泛关注,中药注射剂中鞣质将使血液中的蛋白质凝固,从而引起皮下出血;多次注射局部组织可能导致组织坏死,造成无菌炎症;加速红细胞的凝聚,并能与血红蛋白形成药物性沉淀。此外,鞣质检查也是中药注射剂的特殊检查项目之一。
一、仪器
电子分析天平：Mettler Toledo ME204 CAB-002
紫外可见分光光度计：Agilent Cary60 CUV -001
水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 中药所005
二、试剂及样品
1、试剂：
干酪素 AR 250g 批号 20160812 天津市福晨化学试剂厂
磷钼钨酸试液 AR 500ml 批号 20170817 天津市光复精细化工研究院
无水碳酸钠 AR 500g 批号 20120526 国药集团化学试剂有限公司
2、对照品
没食子酸 约30mg 110831-201605 中国食品药品检定研究院 纯度90.8%
3、样品：
XXX注射液 20170207 超滤后样品、20170209 超滤后样品
三、实验依据：
《中国药典》2015年版四部 2202鞣质含量测定法
四、实验过程：
1、对照品溶液的制备：取2017年09月11日配制的对照品溶液（0.04867mg/ml）
2、供试品溶液的制备：分别精密量取20170207、20170209批样品10ml,分别置100ml容量瓶置，加水稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。
3、最大吸收波长的测定：精密量取对照品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液lml，加水10ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇勾，放置3 0分钟，以相应的试剂（水）为空白，在500nm-800nm波长范围内扫描，测定其最大吸收波长。
4、总酚 精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液lml，加水10ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇勾，放置3 0分钟，依法在760nm处测定吸光度，从标准曲线计算得供试品溶液中没食子酸的量(mg)。
5、不被吸附的多酚 精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，自“加入磷钼钨酸试液lml”起，加水10ml，同总酚处理方法，依法测定吸光度，同时进行干酪素吸附空白试验，计算扣除空白值，计算没食子酸的量(mg)。
6、按下式计算鞣质的含量：
鞣质含量= 总酚量—不被吸附的多酚量
五、测定数据见报告
1、经光谱扫描，对照品光谱再765nm-750nm波长处有较大的宽幅吸收，可选择760nm作为测定波长。
2、①760nm波长处
总酚吸光度：20170207: 0.2539、0.2521
20170209：0.2714、0.2669；
干酪素吸附空白：0.2186；
不被吸附的多酚吸光度：20170207: 0.2347
20170209： 0.2682
以曲线方程 y=108.48x+0.0661 R2=0.9926
样品鞣质浓度为（X总-X不）*25*100/2
则20170207 鞣质含量C1=0.22mg/ml, C2=0.20mg/ml, C平均=0.21 mg/ml；
20170209 鞣质含量C1=0.037mg/ml, C2=-0.015mg/ml, C平均=0.011 mg/ml；
②755nm波长处
总酚吸光度：20170207: 0.2540、0.2523
20170209：0.2719、0.2669；
干酪素吸附空白：0.2186；
不被吸附的多酚吸光度：20170207: 0.2353
20170209： 0.2690
以曲线方程 y=108.92x+0.0651 R2=0.9928
样品鞣质浓度为（X总-X不）*25*100/2
则20170207 鞣质含量C1=0.21mg/ml, C2=0.19mg/ml, C平均=0.20 mg/ml；
20170209 鞣质含量C1=0.033mg/ml, C2=-0.026mg/ml, C平均=0.003mg/ml。
3、结果分析：
①760nm、755nm波长处结果和曲线无明显差异；
②20170207总酚和不被吸附的多酚吸光度能较好的区分，20170209总酚与不被吸附的多酚吸光度较接近，结果准确性较差；
③可能 由于样品中鞣质含量较低，其他酚类物质较多，且干酪素吸附实验条件对结果影响较大，吸附能力较弱，需考察干酪素吸附的影响因素；
④样品稀释100倍后吸光度较为合适，不被吸附的多酚实验中滤液较为澄清，也可以继续考察其他稀释倍数。
参考文献：
1、中国药典2015年版四部22202鞣质含量测定法。
2、沈洁 浙江大学药学院 《磷钼酸-干酪素法测定丹参药材中鞣质含量》分析化学2008.04
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