a. 流动相中有机溶剂的类型和比例，会影响色谱分离的选择性。对于反相色谱模式，常用的有机溶剂有甲醇、乙腈和四氢呋喃。我们可以通过改变流动相中的有机相种类或调整其比例，来改变选择性和分离度。
b.流动相的pH值和缓冲盐的添加也会影响分离度。对于中性的化合物，无论是极性还是非极性的，流动相pH值的改变不会对其选择性有太大的影响；对于可解离的化合物，pH的改变会产生较大的影响。对于酸性化合物，比如苯甲酸，其pKa为4.2，当流动相pH值大于5.7（pKa+1.5），则苯甲酸以离子型态存在，则与反相固定相之间的作用较弱，保留时间较短，当流动相pH值小于2.7 （pKa-1.5），则苯甲酸以分子形态存在，则与反相固定相之间有更强的保留作用，保留时间更长。同样，对于碱性化合物，当流动相的pH≥（pKa+1.5），则化合物以分子形态存在，对于反相色谱柱保留较强，当流动相的pH≤（pKa-1.5），则化合物以离子形态存在，对于反相色谱柱保留较弱。我们也可以通过添加缓冲盐来调整流动相的离子强度，来改善目标化合物与固定相之间的保留。
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