Kromasil技术支持Q&A---第三弹
7. 为什么会出现色谱峰拖尾？
导致色谱峰拖尾的原因很多，分为以下几类：
- 进样量过多。减少进样量后，峰形会更加对称，或者一个峰会分离为两个独立的色谱峰。解决方法：将样品适当稀释后再进样
- 次级作用。当进样中性化合物（苯乙酮，甲苯）时，可得到对称峰形。解决方法：调节流动相pH以抑制样品电离
此外，在较大内径（>10mm）的色谱柱内形成的径向温度梯度也可导致峰拖尾。为避免此种情况，建议使用柱温箱。柱温应比流动相高1-2℃，以补偿色谱柱核心部分产生的摩擦热。
如果不是上述原因，则拖尾可能是由于填料填充不规则或在柱入口筛板存在局部堵塞而导致的流体不均一。
8. 当柱压升高时需采取什么措施？
高压输液泵提供动力压迫流动相流经固定相，在整个柱长范围内会产生一定的压降δP。填料粒径dp和不可压缩溶剂的线速度u间的关系可以通过Darcy定律来表示：
压降δP与溶剂线速度u、柱长L和流动相粘度η成正比；与常数k0和填料粒径的平方成反比。根据Karman-Cozeny方程，常数k0是填料颗粒间空隙度εi的函数。
Karman-Cozeny公式表明，填料微球间的空隙度εi对填料床层的透过率，即对压降具有很重要的影响。对于装填理想的反相固定相而言，填料微球间的空隙度可假设为0.33，这样就得到k0=4.45x10-4。色谱柱透过性（dp2xk0）在实际操作中完全取决于填料粒径和粒径分布。后者是一个很重要的参数，因为HPLC填料粒径不会完全是单分散性质的。
填料粒径分布宽会导致两大负面效应：
由此，需要避免填料粒径分布区间过宽。
9. 柱效降低的原因是什么？
样品质量或体积过载以及使用错误的样品溶剂都会显著降低色谱柱性能从而影响分离效果。进样体积不得超过流速的10%（如流速为1ml/min，进样体积<100μL）。进样量高出吸附等温线的线性部分就意味着过载。这条分界线不一而足，原则上，每ml柱体积上不得承载超过0.01mg的样品（比如，4.6x250 mm色谱柱最大进样量为22μ g）。若出于检测需要，可增加进样量。样品溶剂的强洗脱组分（反相模式下脂肪醇、乙腈，或者正相模式下脂肪醇、乙酸乙酯等）含量不得超过它们在流动相中的浓度。
2. 柱外体积/死体积
塔板数低通常是由于死体积过大而导致的。死体积是由进样器、连接进样器和色谱柱的导管、连接色谱柱和流通池的导管、流通池、以及任何通过配件、连接部件和在线过滤器等增加的体积的所有体积之和。
内径为0.01''的导管在高效液相色谱系统中最常见。若使用更窄（ID<3.0mm）的色谱柱，可以将内径为0.01''导管更换为0.007''以减少死体积，从而提高色谱性能。使用内径为0.005''的导管可以进一步减少死体积，但操作上不太方便。使用内径小于0.007''的导管对流速有所限制，而且存在缓冲盐析出的可能性。如果您正使用多种品牌的液相色谱柱，请确认用以连接色谱柱的配件是否适配。如果您的色谱系统使用的是不锈钢导管和配件，在连接色谱柱前，请再次核对色谱柱的品牌后选择正确的配件并预先装配好；若使用PEEK材料的导管和配件，推荐在每次更换色谱柱时，选择在新切下的PEEK导管上安装全新的PEEK配件，以确保适配。
10. 色谱峰分裂的原因是什么？
以下原因可造成色谱峰分裂：
- 色谱柱污染
- 筛板局部堵塞
- 无效柱床
- 溶剂效应
- 共洗脱化合物
样品未经过滤或样品溶剂和流动相不一致时，会导致色谱柱污染或筛板局部堵塞。如果是后者，样品组分可能在色谱柱入口处与流动相混合时，或是与筛板的金属质表面接触时产生沉淀析出。
无效柱床常存在于装填不佳的色谱柱中，这是由于流体动力学因素（高流速，高粘度流动相）带来的应力而形成，或者是由于机械冲击（色谱柱掉落）以及在填料的化学溶解（pH>12）而导致。
若样品溶剂的洗脱强度强于流动相时，会出现峰分裂或者峰形变宽，在最先出现的色谱峰上表现得尤为明显。
两种化合物共同洗脱时也会出现峰分裂。此时既可以使用更高柱效（理论塔板数）的色谱柱将两种物质分开，也可使用更小粒径的填料或者增加柱长。升高温度和/降低流动相粘度也会改善分离效果。
此外，一种化合物可能在两种状态下被洗脱出来，比如，离子对试剂用量不足或流动相缓冲能力不够。
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