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趣谈凝胶渗透色谱GPC/SEC – 检测篇I之传统校正

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2019/08/19

分享是令人愉悦的，无论这种愉悦来自于多巴胺，肾上腺素还是尼古丁；
分享是需要勇气的，你需要时间码字，还需要勇于面对没有共鸣时的寂寞；
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　GPC样品经过分离后，将会进入检测器。GPC色谱的分析程度取决于实验中检测器的种类与数量。通过选定不同的检测器，按照不同的校准方法或/和计算方法可以计算出分子量（MW）、分子量分布（PD）、特性粘度（IV）、分子密度、水力半径（Rh）与回转半径（Rg）等参数。同时，也可能获得诸如分子构型、聚集度、支化等大分子结构以及共聚物组成等额外信息。
　　根据检测系统（检测器的数量及类型）的不同，有以下三种实验方法：
1. 传统校准法，使用RI/UV检测器
2. 在线静态光散射，需要光散射检测器和RI/UV检测器连用
3. 普氏校正及其分子结构表征，需要在线粘度检测器和RI检测器连用
传统检测法运用浓度检测器和已校准的GPC柱，能够测量相对分子量和聚合度多分散性。光散射检测器和浓度检测器，能够提供绝对分子量、分子尺寸大小Rg、第二维利系数A2的信息。普适校准法使用粘度检测器、浓度检测器，能够测量真实分子量、分子尺寸大小Rh、特性粘度以及分子聚集与支化的信息。

第二聊：传统校正
如果您的色谱上配备了一个示差折光检测器RI，或者一个紫外检测器UV，那么这套装置是一套完整的凝胶色谱仪器了。我们称RI和UV为浓度检测器，因为他们的响应强度和流经样品池的高分子溶液浓度呈线性正比关系。
示差检测器的简单原理
　　常见的示差折光检测器原理简图，如下所示：其石英池分为检测池和参比池，以玻璃分隔，可以分别通过不同的液体，光束在依次经过检测池和参比池后会产生偏转。参比池在测量过程中是保持不变的参比溶剂，通常是流动相，其折光系数为n0。检测池是流通的，走色谱柱后流出的样品的溶液，其折光系数为n。当高分子溶液经过分离达到检测池中时，由于高分子溶液折光指数ｎ不等于ｎ０，光路产生偏转，在后面两侧的PD检测器能量分布开始产生差值，而这个差值线性正比于高分子溶液的浓度。除了样品溶液和参比溶剂会使光束偏转外，其在通过分隔两室的液相-玻璃-液相界面或在通过检测池壁时的液相-玻璃-空气界面时同样会产生偏转。对于精密分析来说，这些偏转也必须被考虑。在本文中将使用简化光路进分析。简化后光路的液相-液相界面Snell折光定律如图所示。

若偏转角度很小，式【1】在不降低准确率的条件下简化为：

结合式【1】与式【2】，可以发现折光系数的增量与偏转距离x呈正比。

由于光路宽度不可能无穷大，分光镜后两个光学检测器测得的信号总是一大一小，其信号差也与x成正比。因此，我们可以将仪器常数综合为一个检测器校准常数（RI.Cal）。并由于样品溶液浓度较低，我们可以用n0代替n。

紫外检测器的简单原理

紫外检测器是一种常见的色谱浓度检测器，光源发出的一束光通过石英流通池，检测器检测透射光强度。其检测原理是利用了比尔定律：A=ε l c，其中A为吸收度，ε为吸收率正比于dA/dc，l为样品池长度，c为紫外吸收物质的浓度。UV检测器和光散射检测器连用，使我们能在浓度和dn/dc未知的情况下检测绝对分子量，通常在蛋白质的测定中使用。在已知蛋白质消光系数的前提下，就能使用UV检测器测定其浓度。
　　紫外吸收检测器所提供的波长范围通常涵盖190nm - 900nm波长范围，取决于所使用的光源，通常氘灯光源范围为190nm -500nm，卤钨灯的光源范围为430nm - 900nm。市场中较常见的色谱用紫外检测器提供单波长、双波长或者四波长吸收检测，以得到紫外吸收物质的浓度信息。

传统校正　－　相对分子量
　　正如在“分离篇”中所述，在凝胶渗透色谱中分子是根据其流体力学体积实现分离，再使用一个或多个检测器进行对GPC柱的洗脱液进行检测。传统校准法是一种被广泛应用的技术，通常使用示差折光检测器或紫外可见光谱仪进行检测，配以已校准的色谱柱，可供测定相对分子量、分子大小以及聚合物多分散性。
　　在传统校准法中，分子量（Mw）与分子量分布（ＰＤ）是根据以校准曲线对保留体积（Rv）作图（log Mw vs. Rv）计算得到的，而校准曲线可通过对已知分子量的标样进行一系列实验获得。
传统校准法的操作步骤如下：
1. 使用分子量已知的窄分布系列样品进样
2. 测量信号峰的保留体积
3. 建立校准曲线（Log(MW) 对保留体积）
注意：
　　使用测得的保留体积代替时间是为了消除流速的影响，而且您选择的标样必须覆盖被测样品的全部分子量范围。

获得校准数据后，我们可以通过其曲线来描述保留体积与分子量之间的关系，通常使用多项式拟合来计算：

在获得了标准曲线后，计算未知样品分子量就是一个简单的步骤。通常，高分子科学家对分子量分布的至少三种统计学平均分子量感兴趣。它们分别是重均分子量、数均分子量以及Z平均分子量，其定义分别如下：

上图中，Mi是在i点的分子量，Ci是在i点的浓度（或质量分数）。
　　传统校正是最简单的分子量检测方法，优点是仪器构造简单，维护简便，成本相对较低，的缺点是您也许没有与被测样品同类型的标样。请记住，GPC分离是基于流体力学体积，而非分子量。因此，在使用传统校准法测定分子量时，我们必须假设被测样品与标样的密度相同。然而在一般情况下，事实并非这样。所以我们通常把传统校准法的测量结果称为相对于分子质量或“相对标样的”分子量。
事实上很多测试者都有一个疑问，就是相对分子量和绝对（真实）分子量到底相差多少，在多大程度上影响结果的准确性和使用。我们看下面的例子。通过PS我们做了一条校正曲线，当我们检测PS样品时，由于样品和标样的分子密度相同，所以结果没有偏差，50 KDa的PS得到的分子量就是50 K Da。但是当我们检测50KDa的超支化大分子时，由于其分子密度远高于PS，所以流出体积会相对晚很多，在校正曲线上对应的标样的分子量会低很多。实际上，在很多老师合成出来的树枝状高分子和超支化聚合物在检测相对分子量的时候发现只有几千（远低于理论分子量），同样的样品通过光散射得到的绝对分子量实际上有几万。所以，结论是，待测样品的分子密度和标样的分子密度越接近，得到的相对分子量和其真实分子量越接近。

对于很多生产型企业的QA/QC用途，对于很多大学，将合成出来的样品初步检测一下，或者进行趋势性的比较，传统校正得到的相对分子量都可以出色的完成任务。GPC仪器就是一把尺子吗，只不过标样，色谱柱，流动相，温度，流速和计算方法定义了其尺子的刻度，关于出的数据是毫米还是英寸，在比较的过程中并不太重要。
但对于很多科研和研发性质工作而言（由于要最终导出极其严格的科学性结论），相对分子量带来的信息可能不太充分，或者说存在一定程度的不确定性。这时候，绝对分子量的检测尤为重要。

关于标样
对于传统校正，常用的有机相标样为PS和PMMA，他们在极宽的分子量范围内都具有多个点的窄标。PS通常可以用作THF，甲苯，氯仿，三氯苯，DMF流动相，而PMMA可以用作DMF，DMAC，丙酮，氯仿，NMP等等流动相。水相常用的标样有PEO，dextran，普鲁兰多糖等等。
不同种类的高分子的校正曲线会有所不同，这取决于他们之间的线团密度差。这种差别有多大呢，我们可以看看下图。

很多朋友说，差别也不是很大呀！您可能忽略了纵坐标是log的形式，坐标的3.0代表10^3，而4.0代表10^4。这样看起来，差别还不小吧。
关于不同GPC设备之间相对分子量检测结果的可比性和影响因素
影响两套GPC之间传统校正结果可对比性的因素很多，但主要集中在分离造成的区别和标样种类。具体来说如果色谱柱组合类似，分辨率相当，标样一致，那么结果应该也基本相互对应。
流速也应该尽量保持一致，太快的流速会造成色谱柱来不及分离，而导致分布偏窄；而太慢的流速会造成被色谱柱分离后的样品组分再次扩散混合，导致分布不准确。常用的流速范围在0.5-1.2 ml/min之间，感兴趣的朋友可以通过一个熟悉的宽分布样品改变不同流速看看结果之间的差别。
样品浓度是个有讲头的参数。太高的样品浓度可能导致色谱柱饱和，达不到较好的分离度；而太低的浓度无疑会导致信号较弱，信噪比较低，这会影响结果的准确性和精确性。一般来讲，我们的经验是低分子量样品配置浓度可以稍高，而高分子量的可以稍低。给大家一个建议性的参考，以进样量100uL为标准，几千 Da样品浓度配置5-8mg/ml；几万到十几万 Da样品2-5 mg/ml；几十万到一百万一下Da样品 1 mg/ml；而百万级别或者更高分子量样品零点几mg/ml就好了。
趣谈１之GPC的一些野史
传说中GPC最早使用的是多孔的高岭土作为填料，当然这只是传说，即使当填料也需要烧成多孔的陶瓷吧。后来，后来据说是七几年陶氏化学做出了商业化的多孔高分子球，于是GPC的分离有了保障。应该是W公司最早将GPC设备商业化，这对于当时的高分子聚合物研究工作者来说无疑是一个大好消息。因为，大家当时都在用粘度法啊（粘均Ｍｖ），端基滴定啊（数均Ｍｎ），单机静态光散射啊（重均Ｍｗ），渗透压法啊．．．．．来测分子量，也只有做过的人才知道这是多么苦逼的工作。而GPC一个测试就可以得到Ｍｎ，Mｗ，Mｚ，分子量分布，生活中一下子撒满了阳光。

趣谈2 之RI溶剂峰
溶剂峰有个别名，叫鬼峰（ghost peak），因为即使你进一针和流动相相同的溶剂，也会有溶剂峰出现，至于具体原因，众说纷纭。
RI溶剂峰就是GPC流出曲线最后流出那个峰，本来想写最后那个“小峰”，但有的时候它还真不小。形状吗，千奇百怪，环肥燕瘦。因为它是最后流出来的，所以按照GPC的原理来说，这个峰中包含的都是 — 小分子，很小很小的分子，如盐类，溶剂，样品中残留的一些单体，寡聚体等等。
如果溶解样品的溶剂和流动相不同，那么溶剂峰会很大，大到有时候你的注意力都被溶剂峰吸引了，反而忽略了前面的样品峰。

趣谈3 之基线定义和积分范围选取
所谓基线，就是色谱在跑溶剂时的信号响应。只要信号稳定，拉基线从那个位置开始拉并不重要，出峰之前，出峰前/后，出峰以后都可以，记住基线反应的是溶剂相应就够了。一个拉基线的误区是在出峰点和所谓的峰落下点定义，有时候这是不正确的。
需要注意的是，一些公司的软件具有自动识别出峰和基线的功能，使用自动识别功能时最好还是要检查一下。
积分线定义了要积分的样品峰范围，这个其实大部分单RI检测器相对分子量测试没啥好讲的，遇到多个出峰的情况就仁者见仁了，看您需要哪些出峰的信息。

趣谈4 之RI基线飘呀飘
很多用户使用RI检测器时遇到一个问题，就是基线信号漂移（不稳）。漂移的影响不言而喻，影响测试结果，影响重复性，关键是，它影响心情了啊！为啥我换了流动相冲了半天它还在漂？为啥我重新启动机器一夜后它还在漂？
想解决问题，首先要弄清问题的根源。示差信号漂移来源于折光指数n的变化，当然检测池和参比池中任一液体折光指数变了，RI读数就会变化。而液体的折光指数依赖于两个因素，即浓度和温度。
折光指数随浓度增量称作dn/dc，是n随溶质浓度变化的程度。如果您的流动相中含有盐分（或者其他小分子），而流动相瓶中盐分分布不均匀，那么随着流动相的进入，检测池中液体浓度的改变足以引发RI漂移。这么小的浓度梯度变化也能引起RI漂移？就是这么神奇！RI检测器是对浓度非常敏感的哦！改进之道是在流动相瓶中加一个磁子，随时都让磁子保持低速转动，这会极大改善含盐的流动相的RI信号。
折光指数随温度的增量称作dn/dT，是n随溶质温度变化的程度。如果您的RI温度不稳定，那么RI信号随温度的漂移就再正常不过了。所以，通常我们建议将RI的温度设置到室温10度以上的水平，这有利于RI检测器的温度稳定。

好了，先聊到这里，祝大家身体健康，工作顺利！

下贴预告：
凝胶初辟本相对，打破传统需散射，
趣谈凝胶渗透色谱GPC/SEC - 检测篇II之静态光散射和绝对分子量，
博士最喜欢的光散射检测器就要来了！

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zyl3367898

第1楼2019/11/04

应助达人

可以出系列丛书。

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锁龙

第2楼2020/04/22

写的太好了，很有帮助。

0

附近的发货

第3楼2021/02/24

写的太有帮助了，感谢作者

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