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均匀设计实验优化茵陈多糖的提取工艺

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2019/08/26
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中药/天然药检测

均匀设计实验优化茵陈多糖的提取工艺

摘要

目的：探索提取温度、液固比和提取时间对茵陈多糖产率的影响，得到提取茵陈多糖最优工艺条件。方法：用均匀设计实验优化茵陈多糖的提取工艺，用苯酚硫酸法测出每次实验所得多糖的纯度，再求得每次实验纯多糖的得率，然后应用回归分析的方法分析实验得出的数据，以纯多糖的得率为指标，对提取温度、液固比和提取时间3个因素进行分析，得出最佳工艺条件，并进行验证。结果：实验得出茵陈多糖的最佳提取条件是：提取温度100℃、提取时间80 min、提取液固比55:1。结论：验证实验平均得率为1.96%，预测值是2.00%，二者很接近，说明我们得到的最佳工艺条件是可靠的。
关键词：茵陈多糖；提取工艺；均匀设计
Optimize the ExtractionProcess of Herba artemisiae polysaccharide by Uniform Design Experiments
ABSTRACT
Objective: Study the effect of extraction temperature, liquid-solidratio and extraction time on the yield of Herba artemisiae polysaccharide, andthen get the optimal process conditions of extraction. Methods: optimize the extraction process of Herba artemisiae polysaccharideby uniform design experiments, measure the purity of polysaccharide obtained ineach experiment by the phenol-sulfuric acid method, and calculate the yield of purepolysaccharide in each experiment, then use the regression analysis to analyzethe experimental data, the yield of pure polysaccharides as the indicators, getthe conclusion and verify it. Result: thebest extraction condition of Herba artemisiae polysaccharide is: 100℃ as the extraction temperature, 80 min asthe extraction time and 55:1 as the extraction liquid-solid ratio.Conclusion: the result of verification test is 1.96%, and the predictedvalues is 2.00%.They are very close. So the technological conditions isreliable.
Key words:Herba artemisiae polysaccharide; Extraction process;Uniform design

1 前言

多糖，又称为多聚糖，是由十个以上的单糖通过苷键连接而成的聚合物。多项研究表明，多糖具有增强免疫功能、抗肿瘤、降血糖、抗衰老、抗病毒等功能。具有生物学功能的多糖被称为“生物应答效应物”或活性多糖，事实上大多数多糖为活性多糖，主要存在于菌类、藻类、根茎类药材中，本实验所探究的多糖为茵陈多糖，茵陈属于全草类药材。茵陈为菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陈蒿Artemisia capillariesThumb.的干燥地上部分。应在春季幼苗高6-10cm时采收或秋季花蕾长成花初开采割，除去杂质和老茎，晒干，采摘的季节不同，茵陈可分为绵茵陈和花茵陈两种，春季采摘的名为绵茵陈，秋季采摘的名为花茵陈。茵陈生产地在我国分布广泛，不同生产地生产的茵陈质量不同，优良的茵陈性状应为多卷曲成松散的团状，灰白色或灰绿色，全体密被白色茸毛，绵软如绒，气清香，味微苦。味苦、辛、微寒、无毒，归脾、胃、肝、胆经。结合古时和现代医学研究，茵陈多糖具有利胆、护肝、调脂降压、抗菌、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗氧化、清热解毒等功效。
多糖的提取方法很多，大体上包括溶剂浸提法、酶法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和超临界流体萃取法。本实验采用水提醇沉法对茵陈多糖进行提取，虽然该方法提取工艺中要求要控制温度、时间、加水量等，但该方法工艺简单，适合在实验室操作。
本实验采用的方法为均匀设计法，在条件范围变化大而需要进行多水平实验的情况下，它能够极大的减少实验的次数，只需要与因素水平数相等次数的q，本实验即可获得正交设计的至少做q²组实验所能获得的实验结果。

2 实验部分

2.1 实验仪器和试剂
752型紫外可见分光光度计（上海恒平科学仪器公司）
CPJ1003型电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）
HH-1型恒温水浴锅（金坛市晶玻实验仪器厂）
80-2离心机(上海荣泰生化工程有限公司)
RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）
GZX-9070数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）
ZKXF-1型真空干燥箱(郑州南北仪器设备有限公司)
SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵（保定市新区阳光科教仪器厂）
20目，100目标准筛（浙江上虞市华丰五金仪器有限公司）
移液枪（上海佳安分析仪器厂）
茵陈（河北省安国药材市场，经本考研室徐红欣老师鉴定）
无水乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）
蒸馏水（实验室自制）
葡萄糖（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）
苯酚（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）
浓硫酸（分析纯，北京化工厂）
2.2 茵陈粗多糖提取
1、将茵陈在70℃真空干燥3h，然后用粉碎机粉碎，取20目~100目的粉末，置于干燥器中，备用。

2、精密称取2.5g的茵陈，加入规定液固比的蒸馏水，在设定温度下水浴加热回流t小时。
3、先用脱脂棉过滤，再用布氏漏斗抽滤，滤液旋转蒸发直至滤液浓缩至约10mL。
4、将浓缩的滤液置具塞锥形瓶中，再加30mL的无水乙醇，放入冰箱中，4℃放置24小时。
5、将溶液转移至离心管内，并在3000rpm下离心10min，弃去上清液，取沉淀。
6、50℃真空干燥3.5h后，过夜，取出，放凉，称重，计算产率。

其中，液固比、提取时间t根据实验过程中考察因素的改变，作相应的更改，其他条件保持一致。
2.3 均匀设计实验
本实验依据之前单因素实验结果，确定了温度、液固比和提取时间这三个因素的取值范围，在这个基础上，用茵陈的粗多糖的提取率作为指标，初步确定茵陈多糖的提取条件，再以纯糖的最终收率确定茵陈多糖最优提取条件。首先在茵陈质量一定的前提下，分别设定不同的提取温度、提取时间及料液比，探索它们对茵陈粗多糖提取率的影响。提取完粗多糖，得到茵陈多糖的提取条件，进而再以苯酚-硫酸法测定每组实验的纯糖含量，计算纯糖的收率，并以其作为标准得到茵陈多糖提取的最优条件，最后对最优条件进行验证。
2.3.1 设计实验方案
依据之前单因素实验结果，我们确定了温度、液固比和提取时间这3个因素的取值范围：提取温度X₁ :55℃~100℃；液固比X₂：30:1~75:1提取时间X₃：50min~140min。设计实验方案。每小组均先称量2.5克茵陈，按照设计好的条件对茵陈进行粗多糖的提取，并测定多糖纯度，求得纯多糖产率，方案及结果见表1。

表1 均匀设计实验方案及结果

条件
编号

温度（℃）

液固比

（g/mL）

时间（min）

粗多糖产率(%)

纯多糖产率(%)

50:1

110

12.12

1.13

75:1

11.72

1.03

45:1

140

13.57

1.14

70:1

100

14.93

1.35

40:1

14.39

1.29

65:1

130

13.22

1.54

35:1

13.64

1.74

60:1

13.24

1.28

30:1

120

16.32

2.36

100

55:1

21.59

2.42

2.3.2 标准曲线的绘制
储备液的制备：精密称取葡萄糖0.1246g，加蒸馏水溶解，转移于100mL容量瓶中，再加蒸馏水至刻度，最后摇匀得124.6mg/L的储备液，备用。
标准液的制备：准备5个25mL容量瓶，分别标注1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4 mL、0.2 mL，再分别精密量取储备液1.0 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL，相应置于25 mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀，则得5个不同浓度的标准液，备用。
5%苯酚溶液的制备：称取苯酚1.2512g于烧杯中，用约50℃的蒸馏水溶解，转移至25mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。
标准曲线的绘制：准备6个具塞试管，分别标注1、2、3、4、5、6，先用蒸馏水润洗过的2mL移液管移取2mL蒸馏水于1号具塞试管，然后用相对应的标准溶液润洗过的2 mL移液管分别取2 mL标准溶液于具塞试管中（0.2 mL的标准液对应2号管，0.4 mL的标准液对应3号管，以此类推）。接着用移液枪移取1 mL 5%的苯酚溶液，快速加入上述具塞试管中，充分混匀，再用5 mL移液管移取5 mL浓硫酸快速加入上述试管中，充分摇匀，盖好试管塞（6个试管之间加硫酸间隔5min）。沸水浴15min，冷水浴10min，室温放置5min，最后分别在490nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，以葡萄糖标准溶液C为横坐标，绘制标准曲线。（见图1）
标准曲线的线性范围为：0.10072×10^-4mg/mL ~ 0.50360×10^-4mg/mL
曲线方程：A=0.0146C+0.074，相关系数：r²=0.9992

图1 标准曲线

2.3.3 苯酚-硫酸法测多糖含量
1、分别取上述实验所得粗多糖约0.0600g于小烧杯中，加少量60℃蒸馏水搅拌使其溶解，转移至250mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。
2、分别用布氏漏斗抽滤，取部分滤液，然后用该滤液润洗2mL移液管，移取2mL上述溶液于具塞试管中。
3、再分别用移液枪移取1mL 5%的苯酚溶液，快速加入上述具塞试管中，充分混匀。
4、接着用5mL移液管取5mL浓硫酸快速加入上述试管中，充分摇匀，盖好试管塞（两管加入浓硫酸时间间隔为5min）。紧接着放入沸水浴15min，冷水浴10min，室温放置5min。
5、在490nm处测定其吸光度。
（备注：每次测多糖的吸光度需配制空白对照用来校正可见分光光度计。）
将测得的吸光度带入标准曲线方程中计算出所配溶液的多糖浓度，进而得到纯多糖的质量，再除以所称茵陈样品的质量，即为纯多糖得率，结果见表1。
2.4 最优提取条件的确定
用SPSS 19.0统计软件，以纯多糖得率为评价指标对各因素进行线性回归分析，模型的优度通过复相关系数和方差分析来判定。结果如表2。
表2 回归方程

	回归方程式	R	P
回归方程1	Y＝0.023X₁-0.008X₂+0.002X₃	0.990	0.000
回归方程2	Y＝0.020X₁	0.985	0.000

表2中，Y为纯多糖得率，X1为提取温度，X2为液固比，X3为提取时间。方程1，R²＝ 0.971，P值为0.000，回归非常显著， X1项P值为0.000小于0.01，回归非常显著，有统计意义，而X2，X3均回归不显著，方程1多糖产率预测值为2.17%；方程2为将各项及其交叉乘积项全部纳入进行逐步回归的结果，我们发现，最后的方程中只保留了X1项，方程2的 R²＝ 0.976，X1项P值为0.000，小于0.01，回归亦非常显著有效，其预测值为2.00%。
综合上述两方程的回归结果，及均匀设计和单项实验的结果，我们采取提取温度100℃、提取时间为80 min、提取液固比为55:1，即第10组的条件为最佳条件。
2.5 最优提取条件的验证
均匀设计实验优选出了茵陈多糖提取的最佳条件，即提取温度为100℃、提取时间为80 min、提取液固比为55:1。按照上述茵陈多糖的提取及苯酚-硫酸法测多糖含量测定的实验流程，对最优条件进行3次重复实验，粗多糖及纯多糖的产率均列于表3中。

表3 最优提取条件测得的多糖含量

实验编号	粗多糖得率（%）	纯多糖得率（%）
1	22.61	1.95
2	21.24	2.04
3	18.55	1.88
平均值	20.80	1.96

3 结果与讨论

3.1 实验结果
本实验采用水提醇沉法对茵陈多糖进行提取，在单因素实验结果基础上，通过对液固比、提取时间、提取温度等3个可控条件进行均匀设计实验，结合实验结果得出来的数据，确定了茵陈多糖提取的最优条件，并利用该最优条件测定了茵陈多糖的含量，计算出了纯多糖的得率。结果如下：

表4 茵陈多糖提取最优条件及多糖含量

最优提取条件

粗多糖得率

（%）

纯多糖得率

（%）

提取温度

提取液固比

提取时间

提取次数

100℃

55:1

80 min

1次

20.80

1.96

3.2 讨论
（1）本实验采取的是水提醇沉法，所以在提取粗多糖时，除被考察因素温度、液固比、提取时间按要求改变外，其他条件均应保持一致，如旋蒸时的温度、水浴水位高度、干燥时的真空度，离心时的转速和时间等。若条件不一致，可能造成实验结果的误差。
（2）粗多糖在真空干燥时，温度不宜过高，应在50~60℃之间，过低的温度不能将粗多糖干燥彻底，过高的温度则容易使粗多糖碳化，造成误差。
（3）在旋转蒸发时，除要保证水位大致一样时，旋转时还要注意避免溶液爆沸，导致溶液进入，造成实验误差。
（4）在绘制标准曲线时需注意以下几点：1、配制溶液过程中，需要将溶液转移至容量瓶时，一定得精确至刻度，并且摇匀。2、在移液时要准确迅速，用同一移液管，并且在转移之前要用相对应的溶液润洗。3、再加苯酚和浓硫酸后，要迅速充分摇匀，加浓硫酸的间隔时间个人建议为5分钟，因为间隔时间过短容易手忙脚乱导致误差。
参考文献
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附件：

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