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Luna HILIC应用于糖类药物的分析

歪果仁zZ

2019/10/10
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原创大赛公告

Luna HILIC应用于糖类药物的分析
多糖作为药物，其含量直接影响药效的发挥，但由于多糖药物结构的不均一性，导致不同方法测定的含量存在较大的差异。因此含量测定作为多糖药物质量标准中的关键环节之一，越来越受到重视。
目前有关多糖的研究多集中在其来源鉴别、化学结构、载药性能及药理活性等方面，由于多糖类药物分子量不均一，结构复杂，生物体内存在结构相似的内源性多糖可干扰外源性糖药物的测定，因而体内浓度检测较困难，关于多糖在生物体内药代动力学特征的研究相对较少。
HILIC是HydrophilicInteraction Chromatography的简称，即“亲水性相互作用色谱”。在HILIC模式下，通过键合极性官能团的固定相与反相模式常用的CH3CN / H2O系流动相的组合，来对亲水性化合物进行保留与分离，因此，HILIC是在HPLC的分离模式中最常使用的反相模式的反相，故也被称为“反反相模式”。PC HILIC色谱柱将构成细胞膜的成分作为官能团，对亲水性化合物的保留具有优势。
在HILIC模式下，亲水性的固定相表面形成了水和相，样品的分配在流动相与水和相之间进行。因此，与水和相亲和力较强的极性化合物会被保留，而弱极性化合物基本不被保留，很快被溶出。因为显示出与反相模式相反的分离模式，对在反相模式下难以取得保留的极性化合物能够发挥优势。
使用MIM（Q1=Q3）模式并根据保留时间顺序确定聚合程度（在HILIC柱上聚合度越高保留时间越靠后）筛选响应高的电荷状态，将筛选的离子作母离子在负离子模式下进行MRM条件摸索，所用仪器为：API 4000型三重四级杆串联质谱仪，美国 AppliedBiosystem Sciex 公司；美国Aglient Technology公司1260型液相色谱仪，包括：G1312B二元泵，G1322A 在线脱气机，G1316A 柱温箱；日本SHISEIDO 公司NASCA F5100型自动进样器。色谱柱：Luna 3um HILIC200 A，流动相：A 5mM NH4Ac-水，B 5mM NH4Ac-乙腈，梯度洗脱：0-40min，5%-35% A，流速：300ul/min。进行质谱条件摸索时，发现子离子较多较乱，无法确定特征子离子，决定采用磺达肝癸纳这个纯品五糖分子作为模式分子同样在HILIC柱上进行MRM条件及液相条件摸索，磺达肝癸纳信息如图1：

图1 磺达肝癸纳分子式
液相及质谱条件及色谱峰结果：流动相：A 5mM NH4Ac-水，B 5mM NH4Ac-乙腈。等度洗脱：0-7min，55% A。流速：300ul/min 。表1为磺达肝癸纳质谱条件：
表1 磺达肝癸纳质谱条件

图2 磺达肝癸纳液质色谱峰
由磺达肝癸钠启示，母离子减掉SO₃作为子离子非常特征因而响应比其他碎片离子响应高，那么依诺肝素子离子的MRM条件摸索可以考虑减掉SO₃后的碎片离子做子离子，但依此摸出的依诺肝素MRM条件部分离子虽特征（保留时间可以对上）但响应极差（小于1*e⁴），仅可作为定性使用，认为磺达肝癸钠的摸出的特征子离子模式不适合依诺肝素作参考。图2为磺达肝癸纳液质色谱峰。随后摸MRM条件时选择了响应较高的子离子，不特征（峰分不开，因计算多电荷分子量时有重复数据）但响应较高，采用母离子减掉SO₃作为子离子的模式对每个峰定性，发现18-24min为dp4，22-28min为dp6，这与之前MIM 模式根据保留时间推出来的寡糖单元相吻合，dp8可忽略不计。
HILIC柱可用于多糖类药物的分析，我们还在进一步实验探究多糖类药物在HILIC柱上的洗脱规律。
参考文献
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