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PITC衍生化测定氨基酸

whhongdan

2019/11/16

用PITC衍生化测定甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的含量
测定步骤：
1. 用纯水配制甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的混合液，其浓度都大约为0.05mg/mL，得到甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的混合标准溶液。
2. 配制1.2%PITC乙腈溶液和14%TEA乙腈溶液。
3. 衍生化过程：取200uL氨基酸混合标准溶液于1.5mL离心管中，然后加入100uL1.2%PITC乙腈溶液和100uL14%TEA乙腈溶液，摇震使其混合均匀，然后于水浴锅中水浴加热1小时，然后加入500uL正己烷萃取两次，最后取下层液200uL于HPLC瓶中,然后再加入400uL水稀释，用HPLC分析。

色谱条件：
柱子：Agilent SB-Aq 250mm*4.6mm, 5um
流动相A：50mM NaAC (pH=6.5)
流动相B：50mM NaAC (pH=6.5):ACN=1:1
Time:0-10-25-40min
B%:5%-5%-95%-95%
进样量10uL

出现问题：
1. 甘氨酸和谷氨酰胺衍生化峰会分叉。
2. 会出现很多杂峰，尤其是在强洗脱部分。

whhongdan

第1楼2019/11/16

是标准品还是样品出现了这两种情况啊？如果是样品的话，属于正常现象，如果是标准品可能是柱子曾用于其他样品的分析或使用时间过长。

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