夜市
第1楼2007/02/07
六、需购置的Rt-PCR材料:
(生工. Tel. 2236106.)
Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
—— -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
—— 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
(1543. 994. 697. 515. 377. 231)
七、引物合成
1、内参照:
GAPDH
正义:5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′
反义:5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′
β-actin
正义:5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′
反义:5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′
2、par-4:
正义:5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′
反义:5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′
3、退火温度计算
2(A+T)+4(G+C)
正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)
4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好
5、引物稀释:
加DEPC水量为(μl)
= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。
九、几个注意点:
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?
2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前,打开离心机预冷。
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
夜市
第2楼2007/02/07
一、 防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA的分离与纯化
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾,通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的mRNA。