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在制备面筋蛋白的过程中被氧化了？

wuruiqiqi

2020/04/07

我要测定面团当中的自由巯基含量。用的Ellman方法（蛋白质提取后加入DTNB显色反应，测412nm吸光度）。
这是我的操作。
按照国标方法清洗面筋，然后冷冻干燥，磨粉过筛后制备得到面筋蛋白粉末。
用10ml 8M尿素-Tris/Hcl溶液溶解0.1g面筋，磁力搅拌1h。
10000g离心10min，取上清液1 ml 加入4ml 8M尿素-Tris/Hcl，100ul 4mg/ml DTNB.
然后就没有颜色反应。
面筋蛋白溶液加巯基乙醇和盐酸胍处理之后，用三氯乙酸沉淀蛋白，结果盐酸胍晶体析出，导致后来不加盐酸胍了（这个问题又是闹哪样！）。沉淀后的蛋白质用8M尿素溶解加DTNB有颜色反应，说明方法没问题，二硫键也存在的好好地。
问题出在哪里呢？我用半胱氨酸溶液和DTNB反应，有颜色反应，说明DTNB没问题。自由巯基容易被氧化，是在制备面筋蛋白的过程中被氧化了？还是有其他什么原因呢。我看很多中文文章都测过，很容易的样子，可是我一直没搞定。

whrboy

第1楼2020/04/07

tris/Hcl （1L里溶解20.4gtris，6.9gglycine，1.2gEDTA） pH 8.0，ellman以及其他试剂都用的这个tris/Hcl 配置的。
显色液我用的8M尿素溶液（溶解在tris/hcl ，没有SDS）。
显色5min。（发现没颜色，一直放着，也都没颜色）
没有水浴，室温放置的。

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