慢病毒载体转染技术

小小矮马

2022/10/10
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慢病毒载体感染技术

慢病毒载体感染技术已经被广泛应用于RNA干扰技术中。使用慢病毒载体，shRNA被导入宿主细胞的细胞核内，根据启动子不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录，这些前体结构被加工形成pre-shRNA，随后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除发卡结构，产生在两个3’末端带有两个游离碱基的20-25 nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后与Argonaute (Ago) 等蛋白质因子结合，形成RNA诱导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC)。作为RISC的一部分，siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA，在镁离子和ATP的参与下，Ago切割靶标RNA，产生的RNA片段被快速降解，从而在转录后水平沉默靶基因的表达^[63-65]。

凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族。内源性细胞凋亡途径始于线粒体，细胞色素C从线粒体内释放是关键的一步。在细胞凋亡信号的刺激下，细胞色素C从线粒体释放到胞浆，并与凋亡细胞蛋白酶激活因子Apaf-1结合，在dATP存在下，募集并激活caspase-9，形成Cyto-3-Apaf-1-caspase-9凋亡体，激活下游的效应蛋白酶，如caspase-2、3、6、7、8、9，启动caspase的级联反应，引起细胞凋亡。caspase被认为是凋亡的中心实施者，caspase9是调控caspase，参与打靶与激活调控，激活caspase3。caspase3处于凋亡级联反应的核心位置，是效应caspase，是参与凋亡的效应物。caspase3的主要底物是聚合酶PARP，在细胞凋亡启动时，PARP通过caspase的裂解剪切参与凋亡的发生。cappase-3对PARP的蛋白水解作用是凋亡实施的早期事件或前提条件。Bcl-2是一种具有抑制细胞凋亡作用的蛋白，能够抑制caspase激活，结合Apf-1及caspase-9，并维持其非活化状态，抑制caspase级联反应，并且抑制线粒体释放细胞色素C，防止细胞凋亡^{[78, 79]}。实验中，我们通过western blot检测相关蛋白发现，与对照组相比，cleaved-caspase3、cleaved caspase-9、cleaved PARP的表达量增加，而Bcl-2抗凋亡蛋白表达量减少，PARP表达量明显下降，表明，MSI1低表达促进了凋亡的产生。