完全培养基配置:过滤 55 mL Gibco 胎牛血清,加入到 500 mL1640 培养基中,加入 5 mL 抗青霉素链霉素,7.5 mL HEPES 溶液,用于 H69、H82、H526 细胞的培养; 过滤 50 mL Gibco 胎牛血清,加入到 500 mL 的 L15 培养基中,加入 5 mL 抗青霉素链霉素,7.5 mL HEPES 溶液,用于 SW1271 细胞的培养,充分混匀放置 4℃保存。
%4. 10%APS:称取 0.1 g 过硫酸铵溶于 1 mL ddH2O 中,放置 4℃ 保存。
%4. 5×Tris-Glycine Buffer 电泳缓冲液:称取 15.1 g Tris,94 g 甘氨酸,5 g SDS,用ddH2O 定容至 1 L,充分搅拌溶解,室温保存。
%4. 转膜缓冲液:称取 Tris 15.14 g,甘氨酸 72.16 g,用 ddH2O 定容至 1 L,充分搅拌溶解,室温保存。然后每次使用时取 200mL 转膜液和甲醇 200 mL,用 ddH2O 定容至 1 L 充分混匀。
%4. 10% SDS:称取 10 g SDS,ddH2O 定容至 100 mL,68℃ 加热溶解,调整 pH 至7.2,室温保存。
%4. 5% 脱脂牛奶封闭缓冲液:称取 1 g 脱脂奶粉溶于 20 mL TBST Buffer 充分溶解,4℃保存。
%4. TBST Buffer:8.8 g NaCl 和 1M Tris-HCl (pH 8.8) 20 mL,溶解于 1000 mL ddH2O中,加入 0.5 mL Tween 20 混匀,4℃ 保存。
细胞培养及传代
%4. 细胞复苏:从液氮中取出细胞后,将细胞冻存管用细胞复苏盒迅速转移至 37℃ 恒温水浴锅中,轻摇使细胞迅速解冻。细胞解冻后立即吸取至 10 mL 的完全培养基中, 吹打混匀,900 rpm 离心 8min。吸弃上清,用 5 mL 完全培养基重悬细胞,将细胞接种至 25 cm2 培养瓶中,恒温 37℃,5% CO2 条件下培养。
%4. 细胞传代:贴壁细胞吸弃培养基后用 5 mL 1×PBS 清洗 2 次,吸弃上清,每 25cm2 培养瓶或 6 cm 培养皿加入 1 mL 胰酶消化 2 min。镜下观察细胞开始脱落,加入 2mL 完全培养基终止消化,移入 15 mL 离心管内,900 rpm,离心 8 min。悬浮细胞直接移入 15 mL 离心管内,900 rpm,离心 8 min。吸弃上清液,加入新鲜培养基重悬细胞并吹打混匀。将细胞按实验需求接种于培养瓶或培养皿中,培养条件同上。
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