分析方法验证中专属性相关问题的探讨

分析方法验证中专属性相关问题的探讨

对于专属性，中国药典给出的定义是在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等）可

能存在下，采用的分析方法能正确测定出被测物的能力。具体的操作方法是加标或者强制降解比较测定结果。描述看似很详细，但缺少具体操作的描述，也没有说明规定的理由，这就会导致日常验证中弄不清技术要求和法规要求的区别，或过于严格，或为了应付检查而做的过于简单，或按照自己浅显的理解做错，造成最终的结果不尽人意。为了对专属性的要求有更好的理解，下面就对专属性的相关问题进行相应的探讨。

1. 峰纯度问题：专属性验证中都要求考察峰纯度，确认主成分峰为单一成分的峰。峰纯度的原理是工作站根据光谱匹配度来衡量峰纯度，即峰上各个时间点采集到的光谱归一化处理后几乎一样，具体操作是用DAD检测器进行峰纯度扫描，一般峰纯度因子超过990即认为该峰是单一成分的峰。但利用光谱进行纯度检测也有一定的局限性：首先如果混合物中组分的光谱相似，那么各个时间点采集到的混合光谱几乎是一致的，也会得到很高的纯度匹配因子；另外如果主成分响应过高，导致峰顶点处的光谱由于响应高而变形，纯度因子就会很低；如果主峰中包含的杂质响应过低，各个时间点采集到的光谱只有主成分的光谱，纯度因子就会很高。所以峰纯度检测不是确定检测峰是否是纯峰的绝对证明，建议最好采用LCMS确认和采用代表性样品（过期样品更好）进行峰纯度确认。

2. 强制降解问题：强制降解试验也称破坏性试验，其试验目的明确。强制降解试验可预测原料药的稳定性或影响制剂的纯度、有效性和安全性。强制降解一般认为样品降解量应在5~20%之间，一般10%。但是由于样品自身的性质问题很多时候会出现不产生降解或者降解剧烈的问题，这时候就需要对破坏时间和强度进行调整，尤其是对于降解不出来杂质的物质，需要在原降解条件基础上加热或者增加破坏时间来达到降解要求。另外强制降解的物料平衡是极为头痛的问题之一，由于物料平衡主要是考察分析方法能否将所有杂质有效检出，所以含量测定没有必要进行物料平衡的考察，物料平衡的接受范围问题，至今没有统一的规定，其实也很难统一，需要具体情况具体分析，根据样品中各组份性质、降解率大小、强制降解杂质的结构、质量标准中杂质限度要求等因素综合考虑，建议为95.0~105.0%较为合适，有些企业制定为98.0%~102.0%，只考虑HPLC方法本身误差，没有考虑未知杂质的结构、介质pH等因素对测定的影响，接受标准过于严格，有些企业对于制剂考虑到辅料影响，制定为90.0%~110.0%，又过于宽松，失去物料平衡考察的意义。

2. 分离度的计算问题：分离度是HPLC测定中重要的系统适用性参数，也是专属性重要的考察参数之一。含量测定方法中一般要求各破坏产物应与主成分达成基线分离，有关物质方法各破坏产物与主成分之间的分离度均应不小于1.5，各杂质之间的分离度均应不小于1.0。目前分离度常用的计算公式是半峰宽法，现代仪器上的积分技术对于两个能完成实现基线分离相邻峰采用这种计算方式没有一点问题，但是对于拖尾峰和峰形不好的峰，尤其是色谱峰峰响应差别大的两组份不完全分离的情形，这种分离度公式会导致结果偏低或偏高，不能有效的反应真正的分离情况，对于这个情况建议采用峰谷比的方式，得到的结果可能更准确。